Terapia com Gentamicina para Pacientes com Epidermólise Bolhosa Distrófica Recessiva (RDEB)

Avaliar a expressão de C7 e AF com tratamento tópico e intradérmico de gentamicina Aplicação tópica de gentamicina na lesão de pele: Aplicaremos pomada de gentamicina 0,1% comercialmente disponível três vezes ao dia sob oclusão de Tegaderm por duas semanas em uma erosão cutânea alvo de RDEB. Da mesma forma, aplicaremos o veículo de controle de pomada três vezes ao dia em uma erosão RDEB de tamanho semelhante. Este esquema de dosagem é baseado no ensaio clínico bem-sucedido em pacientes com FC que resultou em eficácia clínica sem efeitos colaterais.19 Em nossos estudos de cultura celular in vitro, mostramos que uma dose única de gentamicina (400 ug/ml) induziu a expressão de C7 em um nível de 20-40% do observado em células normais (Figura 1A e 1B).23 Em nosso ensaio clínico, a pomada experimental conterá 1 miligrama de gentamicina por mililitro de veículo de pomada.

Injeção de gentamicina na derme alta da pele do paciente RDEB: Além disso, identificaremos áreas-alvo de 2,0 cm x 2,0 cm de pele intacta não ferida dentro de áreas propensas à formação de bolhas e injetaremos por via intradérmica uma solução de gentamicina estéril comercialmente disponível (40 mg/ml em solução salina ). Uma área de controle semelhante será injetada com volumes iguais de solução salina. Injetaremos 200 ul (8 miligramas) em cada local uma vez no dia 0 e novamente no dia 1. Uma única injeção será administrada no local em cada um dos dois dias. A dose total será de 16 miligramas injetados na derme superior onde entrará em contato com os fibroblastos dérmicos e queratinócitos basais do paciente. Em nosso estudo de leitura in vitro publicado, cada 1 cm2 de células cultivadas foi exposto a 400 ugs/ml de gentamicina que mostrou atividade de leitura sem citotoxicidade. Para o estudo intradérmico proposto, usaremos uma dose total aproximadamente 5 vezes maior que a dose in vitro.

Parâmetros iniciais e de acompanhamento: Antes de qualquer tratamento, os pacientes RDEB serão submetidos a uma biópsia de raspagem de 9 mm de pele intacta que será dividida em 3 partes e avaliada para histologia H&E, microscopia eletrônica de transmissão e imunofluorescência direta para expressão de C7. Aos 1 e 3 meses após o tratamento com gentamicina de erosões RDEB ou pele intacta em áreas propensas a bolhas, faremos uma biópsia dos locais tratados e repetiremos as avaliações histológicas, ultraestruturais e de expressão de C7. Para a avaliação da expressão de C7 na DEJ por imunofluorescência (IF), criossecções de 5 mícrons serão sondadas com anticorpos policlonais anti-C7 para os domínios NC1 e NC2 de C7. A expressão aumentada do domínio NC2 de C7 no DEJ da pele ou erosões tratadas com gentamicina servirá como um "marco" importante neste estudo, uma vez que indicaria leitura PTC e restauração de um C7 completo. A terceira parte da biópsia será avaliada ultraestruturalmente e os FAs serão enumerados por morfometria assistida por computador. Esses estudos avaliarão se há restauração das FAs normais. Seções de pele de seres humanos normais servirão como controles positivos, enquanto seções de pele do local de controle do veículo servirão como controles negativos.

Avaliação clínica do paciente: Locais de erosão da pele: Os pacientes serão cegos para os tratamentos de gentamicina e veículo do Local Experimental e do Local Controle. A cada semana, os pacientes avaliarão os locais e classificarão sua cicatrização da seguinte forma: - 1 = aumento da erosão em relação ao seu tamanho inicial; 0 = nenhuma mudança no tamanho da erosão; +1 = cicatrização parcial e erosão menor que seu tamanho inicial e +2 = fechamento completo da ferida.

Em segundo lugar, serão geradas fotografias de linha de base das erosões e a área das erosões calculada por planimetria assistida por computador. Avaliações idênticas serão feitas 1 e 3 meses após o tratamento. Portanto, um segundo "marco" para este estudo será a diminuição das áreas de superfície das erosões tratadas com gentamicina em comparação com as erosões tratadas com controle de veículo.

Avaliação da pele intacta RDEB tratada por injeções intradérmicas de gentamicina: Pacientes e investigadores serão cegos para os tratamentos da Área Experimental e Área de Controle. A cada semana, o paciente avaliará as áreas e as classificará da seguinte forma: - 1 = formação de nova bolha ou erosão no local e +1 = ausência de novas bolhas ou erosões. Nas visitas da USC em 1 e 3 meses, as biópsias serão obtidas dos locais e avaliadas como acima para a expressão de C7 no DEJ e enumeração de AFs.

Avaliação da segurança dos pacientes: os pacientes terão históricos basais, revisão dos sistemas (ROS), sinais vitais (incluindo peso) e exames físicos no dia 0 antes do tratamento e no dia 1 (um dia após o tratamento) e depois no 1 e 3 meses durante suas visitas à USC. Nesses mesmos momentos, exames de sangue serão realizados e incluirão hemograma completo, eletrólitos, enzimas hepáticas, velocidade de hemossedimentação, creatinina e uréia. A depuração de creatinina também será calculada e os locais de tratamento do paciente serão avaliados quanto a eritema, edema, bolhas e erosões. No Dia 0, 1 mês e 3 meses após o tratamento, serão feitas avaliações audiométricas. Os pacientes preencherão um questionário ROS diariamente em casa e serão telefonados semanalmente por um membro do estudo da USC perguntando sobre quaisquer novos sinais, sintomas ou alterações ROS.

E. Caracterização das respostas imunes ao C7 induzido por gentamicina: Todos os pacientes do nosso estudo expressam níveis mais baixos de C7, incluindo o domínio NC1, que é o domínio mais antigênico de C7. Portanto, com exceção do paciente B, duvidamos que a leitura do PTC do paciente induza uma proteína considerada antigênica pelo sistema imunológico do paciente. No entanto, esperamos que a gentamicina gere uma espécie funcional, em vez de não funcional, de C7. Para avaliar se essa alteração desencadeia uma resposta imune e gera anticorpos anti-C7, o soro do paciente será obtido na linha de base, 1 mês e 3 meses para avaliação de anticorpos anti-C7 por IIF salt-split e ELISA. Se um paciente desenvolver anticorpos para C7, examinaremos sua pele para depósitos de anticorpos C7 por DIF.