Gentamysiinihoito resessiivisen dystrofisen epidermolyysibullosa (RDEB) nonsense-mutaatiopotilaille

Arvioi C7:n ja AF:n ilmentyminen paikallisella ja intradermaalisella gentamysiinihoidolla Gentamysiinin paikallinen käyttö ihovaurioon: Levitämme kaupallisesti saatavilla olevaa 0,1 % gentamysiinivoidetta kolme kertaa päivässä Tegaderm-tukoksen alla kahden viikon ajan kohde-RDEB-ihoeroosioon. Samoin levitämme voidekontrolliajoneuvoa kolme kertaa päivässä samankokoiselle RDEB-eroosiolle. Tämä annostusohjelma perustuu CF-potilailla tehtyyn onnistuneeseen kliiniseen tutkimukseen, joka johti kliiniseen tehoon ilman sivuvaikutuksia.19 In vitro -soluviljelytutkimuksissamme osoitimme, että kerta-annos gentamysiiniä (400 ug/ml) indusoi C7:n ilmentymisen 20-40 %:n tasolla normaaleissa soluissa havaitusta tasosta (kuvio 1A ja 1B).23 Kliinisessä tutkimuksessamme kokeellinen voide sisältää 1 milligramman gentamysiiniä millilitrassa voidevehikkeliä.

Gentamysiinin injektio RDEB-potilaan ihon korkeaan dermiin: Lisäksi tunnistamme 2,0 cm x 2,0 cm:n kohdealueet vahingoittumattomasta koskemattomasta ihosta alueilla, jotka ovat alttiita rakkuloiden muodostumiselle, ja ruiskutamme intradermaalisesti kaupallisesti saatavaa steriiliä gentamysiiniliuosta (40 mg/ml suolaliuoksessa) ). Samanlaiselle kontrollialueelle ruiskutetaan yhtä suuret määrät suolaliuosta. Injektoimme 200 ul (8 milligrammaa) jokaiseen kohtaan kerran päivänä 0 ja jälleen päivänä 1. Kohteeseen annetaan yksi injektio kahden päivän aikana. Kokonaisannos on 16 milligrammaa ruiskutettuna dermikseen, jossa se koskettaa potilaan ihon fibroblasteja ja tyvikeratinosyyttejä. Julkaistussa in vitro -lukemistutkimuksessamme jokainen 1 cm2 viljeltyjä soluja altistettiin 400 ug/ml gentamysiinille, joka osoitti läpilukuaktiivisuutta ilman sytoksisuutta. Ehdotetussa intradermaalisessa tutkimuksessa käytämme kokonaisannosta, joka on noin 5 kertaa suurempi kuin in vitro -annos.

Alku- ja seurantaparametrit: Ennen hoitoa RDEB-potilaille tehdään 9 mm:n parranajobiopsia ehjästä ihosta, joka jaetaan kolmeen osaan ja arvioidaan H&E-histologian, transmissioelektronimikroskoopin ja suoran immunofluoresenssin C7-ekspression suhteen. 1 ja 3 kuukauden kuluttua gentamysiinikäsittelystä RDEB-eroosioiden tai ehjän ihon rakkula-alttiilla alueilla, otamme biopsian hoidetuista kohdista ja toistamme histologiset, ultrastrukturaaliset ja C7-ekspressioarvioinnit. C7:n ilmentymisen arvioimiseksi DEJ:ssä immunofluoresenssilla (IF), 5 mikronin kryosektiot tutkitaan polyklonaalisilla anti-C7-vasta-aineilla C7:n NC1- ja NC2-domeeneja vastaan. C7:n NC2-domeenin lisääntynyt ilmentyminen gentamysiinikäsitellyn ihon tai eroosioiden DEJ-kohdassa toimii yhtenä suurena "virstanpylväänä" tässä tutkimuksessa, koska se osoittaisi PTC-lukemista ja täyspitkän C7:n palauttamista. Biopsian kolmas osa arvioidaan ultrarakenteellisesti, ja AF:t luetellaan tietokoneavusteisella morfometrialla. Nämä tutkimukset arvioivat, onko normaalit AF:t palautuneet. Iholeikkeet normaaleista ihmisistä toimivat positiivisina kontrolleina, kun taas vehikkelin kontrollikohdan iholeikkeet toimivat negatiivisina kontrolleina.

Potilaan kliininen arviointi: Ihon eroosiokohdat: Potilaat sokennetaan koe- ja kontrollipaikan gentamysiini- ja vehikkelihoidoista. Joka viikko potilaat arvioivat kohdat ja arvioivat niiden paranemisen seuraavasti: - 1 = eroosion laajeneminen sen alkuperäiseen kokoon verrattuna; 0 = eroosion koko ei muutu; +1 = osittainen paraneminen ja pienempi eroosio kuin sen alkuperäinen koko, ja +2 = haavan täydellinen sulkeutuminen.

Toiseksi eroosioista luodaan peruskuvat ja eroosioiden pinta-ala lasketaan tietokoneavusteisella planimetrialla. Samat arviot tehdään 1 ja 3 kuukautta hoidon jälkeen. Siksi toinen "virstanpylväs" tälle tutkimukselle on gentamysiinikäsiteltyjen eroosioiden pienemmät pinta-alat verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin eroosioihin.

Gentamysiinin intradermaalisilla injektioilla käsitellyn RDEB:n ehjän ihon arviointi: Potilaat ja tutkijat sokennetaan koealueen ja kontrollialueen hoidoista. Joka viikko potilas arvioi alueet ja luokittelee ne seuraavasti: - 1 = uusi rakkula tai eroosion muodostuminen alueelle ja +1 = ei uusia rakkuloita tai eroosioita. USC-käynneillä 1 ja 3 kuukauden kohdalla biopsiat otetaan paikoista ja arvioidaan edellä kuvatulla tavalla C7:n ilmentymisen osalta DEJ:ssä ja AF:iden luetteloimiseksi.

Potilaiden turvallisuuden arviointi: Potilailla on lähtötilannehistoria, järjestelmien tarkastelu (ROS), elintoiminnot (mukaan lukien paino) ja fyysiset tutkimukset päivänä 0 ennen hoitoa ja päivänä 1 (päivä hoidon jälkeen) ja sitten klo 1 ja 3 kuukausia vierailunsa aikana USC:ssä. Samaan aikaan suoritetaan verikokeita, jotka sisältävät täydellisen verenkuvan, elektrolyytit, maksaentsyymit, punasolujen sedimentaationopeuden, kreatiniinin ja BUN:n. Myös kreatiniinipuhdistumat lasketaan ja potilaan hoitopaikat arvioidaan punoituksen, turvotuksen, rakkuloiden ja eroosioiden varalta. Päivänä 0, 1 kuukausi ja 3 kuukautta hoidon jälkeen tehdään audiometria-arvioinnit. Potilaat täyttävät ROS-kyselyn päivittäin kotonaan, ja USC-tutkimuksen jäsen soittaa heille viikoittain ja tiedustelee uusista merkeistä, oireista tai ROS-muutoksista.

E. Gentamysiinin aiheuttaman C7:n immuunivasteiden karakterisointi: Kaikki tutkimuspotilaamme ekspressoivat alhaisempia C7-tasoja, mukaan lukien NC1-domeeni, joka on C7:n antigeenisin domeeni. Siksi potilasta B lukuun ottamatta epäilemme, että potilaan PTC:n lukeminen indusoi proteiinia, jota potilaan immuunijärjestelmä pitää antigeenisenä. Toivomme kuitenkin, että gentamysiini tuottaa toimivan, ei-toiminnallisen, C7-lajin. Sen arvioimiseksi, laukaiseeko tämä muutos immuunivasteen ja tuottaako anti-C7-vasta-aineita, potilaan seerumia otetaan lähtötilanteessa, 1 kuukauden ja 3 kuukauden kuluttua anti-C7-vasta-aineiden arvioimiseksi suolahajotus IIF:llä ja ELISA:lla. Jos potilaalle kehittyy vasta-aineita C7:lle, tutkimme hänen ihonsa C7-vasta-ainekertymien varalta DIF:llä.