Terapia con gentamicina per pazienti con mutazione nonsense di epidermolisi bollosa distrofica recessiva (RDEB)

Valutare l'espressione di C7 e AF con trattamento topico e intradermico con gentamicina Applicazione topica di gentamicina alla lesione cutanea: applicheremo un unguento di gentamicina allo 0,1% disponibile in commercio tre volte al giorno sotto l'occlusione di Tegaderm per due settimane a un'erosione cutanea RDEB target. Allo stesso modo, applicheremo il veicolo di controllo dell'unguento tre volte al giorno a un'erosione RDEB di dimensioni simili. Questo programma di dosaggio si basa sulla sperimentazione clinica di successo nei pazienti CF che ha portato all'efficacia clinica senza effetti collaterali.19 Nei nostri studi di coltura cellulare in vitro, abbiamo dimostrato che una singola dose di gentamicina (400 ug/ml) ha indotto l'espressione di C7 a un livello del 20-40% di quello osservato nelle cellule normali (Figura 1A e 1B).23 Nella nostra sperimentazione clinica, l'unguento sperimentale conterrà 1 milligrammo di gentamicina per millilitro di veicolo dell'unguento.

Iniezione di gentamicina nel derma alto della pelle del paziente RDEB: inoltre, identificheremo aree target di 2,0 cm x 2,0 cm di pelle intatta non ferita all'interno di aree soggette a formazione di vesciche e inietteremo per via intradermica una soluzione sterile di gentamicina disponibile in commercio (40 mg/ml in soluzione fisiologica ). Un'area di controllo simile verrà iniettata con volumi uguali di soluzione salina. Inietteremo 200 ul (8 milligrammi) in ogni sito una volta il giorno 0 e ancora una volta il giorno 1. Una singola iniezione verrà somministrata al sito in ciascuno dei due giorni. La dose totale sarà di 16 milligrammi iniettati nel derma superiore dove entrerà in contatto con i fibroblasti dermici e i cheratinociti basali del paziente. Nel nostro studio read-through in vitro pubblicato, ogni 1 cm2 di cellule in coltura è stato esposto a 400 ugs/ml di gentamicina che ha mostrato attività read-through senza citossicità. Per lo studio intradermico proposto, utilizzeremo una dose totale circa 5 volte maggiore della dose in vitro.

Parametri iniziali e di follow-up: prima di qualsiasi trattamento, i pazienti con RDEB saranno sottoposti a una biopsia rasata di 9 mm di pelle intatta che sarà divisa in 3 parti e valutata per istologia H&E, microscopia elettronica a trasmissione e immunofluorescenza diretta per C7 espressione. A 1 e 3 mesi dopo il trattamento con gentamicina delle erosioni RDEB o della pelle intatta nelle aree soggette a vesciche, biopsieremo i siti trattati e ripeteremo le valutazioni istologiche, ultrastrutturali e dell'espressione di C7. Per la valutazione dell'espressione di C7 al DEJ mediante immunofluorescenza (IF), criosezioni da 5 micron saranno sondate con anticorpi policlonali anti-C7 per i domini NC1 e NC2 di C7. L'aumentata espressione del dominio NC2 di C7 al DEJ della pelle o delle erosioni trattate con gentamicina servirà come una delle principali "pietre miliari" in questo studio poiché indicherebbe la lettura PTC e il ripristino di un C7 a lunghezza intera. La terza parte della biopsia sarà valutata ultrastrutturalmente e le FA saranno enumerate mediante morfometria computerizzata. Questi studi valuteranno se c'è ripristino di FA normali. Le sezioni cutanee di soggetti umani normali fungeranno da controlli positivi, mentre le sezioni cutanee dal sito di controllo del veicolo fungeranno da controlli negativi.

Valutazione clinica del paziente: siti di erosione cutanea: i pazienti saranno accecati dalla gentamicina e dai trattamenti del veicolo del sito sperimentale e del sito di controllo. Ogni settimana, i pazienti valuteranno i siti e classificheranno la loro guarigione come segue: - 1 = allargamento dell'erosione rispetto alla sua dimensione iniziale; 0 = nessun cambiamento nella dimensione dell'erosione; +1 = guarigione parziale e un'erosione minore rispetto alla sua dimensione iniziale, e +2 = chiusura completa della ferita.

In secondo luogo, verranno generate fotografie di base delle erosioni e l'area delle erosioni calcolata mediante planimetria assistita da computer. Valutazioni identiche saranno effettuate a 1 e 3 mesi dopo il trattamento. Pertanto, una seconda "pietra miliare" per questo studio sarà la riduzione delle aree superficiali delle erosioni trattate con gentamicina rispetto alle erosioni trattate con controllo del veicolo.

Valutazione della pelle intatta di RDEB trattata con iniezioni intradermiche di gentamicina: i pazienti e gli investigatori saranno all'oscuro dei trattamenti dell'area sperimentale e dell'area di controllo. Ogni settimana, il paziente valuterà le aree e le classificherà come segue: - 1 = nuova formazione di vesciche o erosione nel sito e +1 = nessuna nuova vescicola o erosione. Alle visite USC a 1 e 3 mesi, le biopsie saranno ottenute dai siti e valutate come sopra per l'espressione di C7 al DEJ e l'enumerazione degli AF.

Valutazione della sicurezza dei pazienti: i pazienti avranno anamnesi basale, revisione dei sistemi (ROS), segni vitali (compreso il peso) ed esami fisici il giorno 0 prima del trattamento e al giorno 1 (un giorno dopo il trattamento) e poi a 1 e 3 mesi durante le loro visite all'USC. In questi stessi punti temporali, verranno eseguiti esami del sangue che includeranno un emocromo completo, elettroliti, enzimi epatici, velocità di eritrosedimentazione, creatinina e azotemia. Verrà calcolata anche la clearance della creatinina e verranno valutati i siti di trattamento del paziente per eritema, edema, vesciche ed erosioni. Al giorno 0, 1 mese e 3 mesi dopo il trattamento, verranno effettuate valutazioni audiometriche. I pazienti compileranno quotidianamente un questionario ROS a casa e riceveranno una telefonata settimanale da un membro dello studio USC chiedendo informazioni su eventuali nuovi segni, sintomi o cambiamenti ROS.

E. Caratterizzazione delle risposte immunitarie al C7 indotto dalla gentamicina: Tutti i nostri pazienti dello studio esprimono livelli più bassi di C7 compreso il dominio NC1, che è il dominio più antigenico di C7. Pertanto, con l'eccezione del paziente B, dubitiamo che la lettura attraverso il PTC del paziente induca una proteina considerata antigenica dal sistema immunitario del paziente. Ciononostante, speriamo che la gentamicina generi una specie di C7 funzionale, piuttosto che non funzionale. Per valutare se questo cambiamento innesca una risposta immunitaria e genera anticorpi anti-C7, il siero del paziente sarà ottenuto al basale, 1 mese e 3 mesi per la valutazione degli anticorpi anti-C7 mediante salt-split IIF ed ELISA. Se un paziente sviluppa anticorpi contro C7, esamineremo la sua pelle per i depositi di anticorpi C7 mediante DIF.