Gentamicin-Therapie für Patienten mit rezessiver dystrophischer Epidermolysis bullosa (RDEB) Nonsense-Mutation

Bewerten Sie die C7- und AF-Expression mit topischer und intradermaler Behandlung mit Gentamicin Topische Anwendung von Gentamicin auf Hautläsionen: Wir werden kommerziell erhältliche 0,1%ige Gentamicin-Salbe dreimal täglich unter Tegaderm-Okklusion für zwei Wochen auf eine Ziel-RDEB-Hauterosion auftragen. Ebenso werden wir das Salbenkontrollvehikel dreimal täglich auf eine ähnlich große RDEB-Erosion auftragen. Dieses Dosierungsschema basiert auf der erfolgreichen klinischen Studie bei CF-Patienten, die zu einer klinischen Wirksamkeit ohne Nebenwirkungen führte.19 In unseren In-vitro-Zellkulturstudien zeigten wir, dass eine Einzeldosis Gentamicin (400 ug/ml) eine C7-Expression in einer Höhe von 20–40 % der in normalen Zellen beobachteten induzierte (Abbildung 1A und 1B).23 In unserer klinischen Studie enthält die experimentelle Salbe 1 Milligramm Gentamicin pro Milliliter Salbenträger.

Injektion von Gentamicin in die hohe Dermis der Haut von RDEB-Patienten: Darüber hinaus werden wir Zielbereiche von 2,0 cm x 2,0 cm unverletzter intakter Haut in Bereichen identifizieren, die zur Blasenbildung neigen, und intradermal im Handel erhältliche sterile Gentamicinlösung (40 mg/ml in Kochsalzlösung) injizieren ). Ein ähnlicher Kontrollbereich wird mit gleichen Volumina an Kochsalzlösung injiziert. Wir werden 200 ul (8 Milligramm) einmal am Tag 0 und noch einmal am Tag 1 in jede Stelle injizieren. An jedem der beiden Tage wird eine einzelne Injektion an der Stelle verabreicht. Die Gesamtdosis beträgt 16 Milligramm, die in die obere Dermis injiziert werden, wo sie mit den dermalen Fibroblasten und basalen Keratinozyten des Patienten in Kontakt kommt. In unserer veröffentlichten In-vitro-Read-Through-Studie wurde jeder 1 cm2 der kultivierten Zellen 400 ug/ml Gentamicin ausgesetzt, das eine Read-Through-Aktivität ohne Zytoxizität zeigte. Für die vorgeschlagene intradermale Studie werden wir eine Gesamtdosis verwenden, die etwa 5-mal höher ist als die In-vitro-Dosis.

Anfangs- und Nachsorgeparameter: Vor jeder Behandlung werden die RDEB-Patienten einer 9-mm-Shave-Biopsie der intakten Haut unterzogen, die in 3 Teile geteilt und auf H&E-Histologie, Transmissionselektronenmikroskopie und direkte Immunfluoreszenz auf C7-Expression ausgewertet wird. 1 und 3 Monate nach der Gentamicinbehandlung von RDEB-Erosionen oder intakter Haut in Bereichen, die zu Blasen neigen, werden wir die behandelten Stellen biopsieren und die histologischen, ultrastrukturellen und C7-Expressionsbewertungen wiederholen. Für die Bewertung der C7-Expression am DEJ durch Immunfluoreszenz (IF) werden 5-Mikron-Kryoschnitte mit polyklonalen Anti-C7-Antikörpern gegen die NC1- und NC2-Domänen von C7 sondiert. Die erhöhte Expression der NC2-Domäne von C7 an der DEJ von mit Gentamicin behandelter Haut oder Erosionen wird als ein wichtiger "Meilenstein" in dieser Studie dienen, da sie auf ein PTC-Durchlesen und die Wiederherstellung eines C7 in voller Länge hindeuten würde. Der dritte Teil der Biopsie wird ultrastrukturell ausgewertet und AFs werden durch computergestützte Morphometrie ausgezählt. Diese Studien werden beurteilen, ob es eine Wiederherstellung normaler Vorhofflimmern gibt. Hautschnitte von normalen menschlichen Probanden dienen als Positivkontrollen, während Hautschnitte von der Trägerkontrollstelle als Negativkontrollen dienen.

Klinische Patientenbewertung: Hauterosionsstellen: Die Patienten werden gegenüber den Gentamicin- und Vehikelbehandlungen der Versuchsstelle und der Kontrollstelle verblindet. Jede Woche beurteilen die Patienten die Stellen und bewerten ihre Heilung wie folgt: - 1 = Vergrößerung der Erosion im Vergleich zu ihrer ursprünglichen Größe; 0 = keine Änderung der Größe der Erosion; +1 = Teilheilung und eine geringere Erosion als die ursprüngliche Größe und +2 = vollständiger Verschluss der Wunde.

Zweitens werden Basisfotos der Erosionen erstellt und die Fläche der Erosionen durch computergestützte Planimetrie berechnet. Identische Bewertungen werden 1 und 3 Monate nach der Behandlung vorgenommen. Daher wird ein zweiter "Meilenstein" für diese Studie verringerte Oberflächenbereiche von mit Gentamicin behandelten Erosionen im Vergleich zu mit Vehikelkontrolle behandelten Erosionen sein.

Bewertung von intakter RDEB-Haut, die mit intradermalen Gentamicin-Injektionen behandelt wurde: Patienten und Forscher sind gegenüber den Behandlungen des Versuchsbereichs und des Kontrollbereichs blind. Jede Woche bewertet der Patient die Bereiche und bewertet sie wie folgt: - 1 = neue Blasen- oder Erosionsbildung an der Stelle und +1 = keine neuen Blasen oder Erosionen. Bei USC-Besuchen nach 1 und 3 Monaten werden Biopsien von den Stellen erhalten und wie oben auf die Expression von C7 am DEJ und die Zählung von AFs ausgewertet.

Bewertung der Patientensicherheit: Die Patienten werden am Tag 0 vor der Behandlung und am Tag 1 (einen Tag nach der Behandlung) und dann am 1. und 3. Tag einer Ausgangsanamnese, Überprüfung der Systeme (ROS), Vitalfunktionen (einschließlich Gewicht) und körperlichen Untersuchungen unterzogen Monate während ihrer Besuche bei USC. Zu diesen gleichen Zeitpunkten werden Bluttests durchgeführt, die ein vollständiges Blutbild, Elektrolyte, Leberenzyme, Erythrozytensedimentationsrate, Kreatinin und BUN umfassen. Die Kreatinin-Clearance wird ebenfalls berechnet und die Behandlungsstellen des Patienten werden auf Erytheme, Ödeme, Blasenbildung und Erosionen untersucht. An Tag 0, 1 Monat und 3 Monate nach der Behandlung werden audiometrische Auswertungen durchgeführt. Die Patienten füllen täglich zu Hause einen ROS-Fragebogen aus und werden wöchentlich von einem USC-Studienmitglied angerufen, das sich nach neuen Anzeichen, Symptomen oder ROS-Veränderungen erkundigt.

E. Charakterisierung von Immunantworten auf Gentamicin-induziertes C7: Unsere Studienpatienten exprimieren alle niedrigere Niveaus von C7, einschließlich der NC1-Domäne, die die antigeneste Domäne von C7 ist. Daher bezweifeln wir mit Ausnahme von Patient B, dass das Ablesen des PTC des Patienten ein Protein induziert, das vom Immunsystem des Patienten als antigen angesehen wird. Dennoch hoffen wir, dass Gentamicin eher eine funktionelle als eine nicht-funktionelle Spezies von C7 erzeugen wird. Um zu beurteilen, ob diese Veränderung eine Immunantwort auslöst und Anti-C7-Antikörper erzeugt, wird Patientenserum zu Studienbeginn, nach 1 Monat und nach 3 Monaten zur Bewertung von Anti-C7-Antikörpern durch Salz-Split-IIF und ELISA gewonnen. Wenn ein Patient Antikörper gegen C7 entwickelt, werden wir seine Haut anschließend mittels DIF auf C7-Antikörperablagerungen untersuchen.