Gentamicinterapi för patienter med recessiv dystrofisk epidermolysis Bullosa (RDEB) nonsensmutationspatienter

Utvärdera C7- och AF-uttryck med topikal och intradermal gentamicinbehandling Topikal applicering av gentamicin på hudskada: Vi kommer att applicera kommersiellt tillgänglig gentamicin 0,1% salva tre gånger om dagen under Tegaderm-ocklusion i två veckor för en mål-RDEB-huderosion. På samma sätt kommer vi att applicera salvkontrollmedlet tre gånger om dagen på en RDEB-erosion av liknande storlek. Detta doseringsschema är baserat på den framgångsrika kliniska prövningen på CF-patienter som resulterade i klinisk effekt utan biverkningar.19 I våra cellodlingsstudier in vitro visade vi att en enstaka dos av gentamicin (400 ug/ml) inducerade C7-expression i en nivå av 20-40 % av den som ses i normala celler (Figur 1A och 1B).23 I vår kliniska prövning kommer den experimentella salvan att innehålla 1 milligram gentamicin per milliliter salvbärare.

Injektion av gentamicin i den höga dermis av RDEB-patients hud: Dessutom kommer vi att identifiera målområden på 2,0 cm x 2,0 cm av osårad intakt hud inom områden som är benägna att bilda blåsor och intradermalt injicera kommersiellt tillgänglig steril gentamicinlösning (40 mg/ml i saltlösning) ). Ett liknande kontrollområde kommer att injiceras med lika volymer saltlösning. Vi kommer att injicera 200 ul (8 milligram) på varje plats en gång på dag 0 och en gång till på dag 1. En enstaka injektion kommer att administreras på stället var och en av de två dagarna. Den totala dosen kommer att vara 16 milligram injiceras i den övre dermis där den kommer i kontakt med patientens dermala fibroblaster och basala keratinocyter. I vår publicerade in vitro genomläsningsstudie exponerades varje 1 cm2 odlade celler för 400 ug/ml gentamicin som visade genomläsningsaktivitet utan cytoxocity. För den föreslagna intradermala studien kommer vi att använda en total dos som är ungefär 5 gånger högre än in vitro-dosen.

Initial- och uppföljningsparametrar: Före någon behandling kommer RDEB-patienterna att utsättas för en 9 mm rakbiopsi av intakt hud som kommer att delas upp i 3 delar och utvärderas för H&E-histologi, transmissionselektronmikroskopi och direkt immunfluorescens för C7-uttryck. Vid 1 och 3 månader efter gentamicinbehandling av RDEB-erosioner eller intakt hud i blåsbenägna områden, kommer vi att biopsia de behandlade platserna och upprepa de histologiska, ultrastrukturella och C7-uttrycksutvärderingarna. För bedömning av C7-uttryck vid DEJ genom immunfluorescens (IF), kommer 5 mikron kryosnitt att sonderas med anti-C7 polyklonala antikroppar mot NC1- och NC2-domänerna i C7. Det ökade uttrycket av NC2-domänen av C7 vid DEJ av gentamicinbehandlad hud eller erosioner kommer att fungera som en viktig "milstolpe" i denna studie eftersom det skulle indikera PTC-genomläsning och återställande av en fullängds C7. Den tredje delen av biopsi kommer att utvärderas ultrastrukturellt, och AF kommer att räknas upp med datorstödd morfometri. Dessa studier kommer att bedöma om det finns återställande av normala AF. Hudsnitt från normala människor kommer att fungera som positiva kontroller, medan hudsektioner från vehikelkontrollstället kommer att fungera som negativa kontroller.

Klinisk bedömning av patienten: Huderosionsställen: Patienterna kommer att bli blinda för gentamicin- och vehikelbehandlingarna på experimentstället och kontrollstället. Varje vecka kommer patienterna att bedöma platserna och gradera deras läkning enligt följande: - 1 = förstoring av erosionen jämfört med dess ursprungliga storlek; 0 = ingen förändring i storleken på erosionen; +1 = partiell läkning och en mindre erosion än dess ursprungliga storlek, och +2 = fullständig stängning av såret.

För det andra kommer baslinjefotografier av erosionerna att genereras och arean av erosionerna beräknas med datorstödd planimetri. Identiska bedömningar kommer att göras 1 och 3 månader efter behandling. Därför kommer en andra "milstolpe" för denna studie att vara minskade ytareor av gentamicinbehandlade erosioner jämfört med vehikelkontrollbehandlade erosioner.

Utvärdering av RDEB intakt hud behandlad med intradermala injektioner av gentamicin: Patienter och utredare kommer att bli blinda för behandlingarna i det experimentella området och kontrollområdet. Varje vecka kommer patienten att utvärdera områdena och gradera dem enligt följande: - 1 = ny blåsa eller erosionsbildning på platsen, och +1 = inga nya blåsor eller erosioner. Vid USC-besök vid 1 och 3 månader kommer biopsier att erhållas från platserna och utvärderas enligt ovan för uttryck av C7 vid DEJ och uppräkning av AF.

Utvärdering av patientsäkerhet: Patienterna kommer att ha baslinjehistorik, genomgång av system (ROS), vitala tecken (inklusive vikt) och fysiska undersökningar på dag 0 före behandling och på dag 1 (en dag efter behandling) och sedan vid 1 och 3 månader under sina besök på USC. Vid samma tidpunkter kommer blodprov att utföras och inkluderar ett fullständigt blodvärde, elektrolyter, leverenzymer, erytrocytsedimentationshastighet, kreatinin och BUN. Kreatininclearance kommer också att beräknas, och patientens behandlingsställen kommer att utvärderas för erytem, ​​ödem, blåsor och erosioner. På dag 0, 1 månad och 3 månader efter behandlingen kommer audiometriutvärderingar att göras. Patienterna kommer att fylla i ett ROS-enkät dagligen hemma och bli uppringda varje vecka av en USC-studiemedlem som frågar om eventuella nya tecken, symtom eller ROS-förändringar.

E. Karakterisering av immunsvar mot Gentamicin-inducerad C7: Våra studiepatienter uttrycker alla lägre nivåer av C7 inklusive NC1-domänen, som är den mest antigena domänen av C7. Därför, med undantag för patient B, tvivlar vi på att genomläsning av patientens PTC kommer att inducera ett protein som ses som antigent av patientens immunsystem. Ändå hoppas vi att gentamicin kommer att generera en funktionell, snarare än icke-funktionell, art av C7. För att utvärdera om denna förändring utlöser ett immunsvar och genererar anti-C7-antikroppar, kommer patientserum att erhållas vid baslinjen, 1 månad och 3 månader för utvärdering av anti-C7-antikroppar genom salt-split IIF och ELISA. Om en patient utvecklar antikroppar mot C7 kommer vi att undersöka deras hud för C7-antikroppsavlagringar av DIF.