Gentamicin terápia recesszív dystrophiás epidermolysis bullosa (RDEB) nonszensz mutációval rendelkező betegek számára

C7 és AF expresszió értékelése topikális és intradermális gentamicin kezeléssel Gentamicin helyi alkalmazása bőrelváltozásokra: A kereskedelemben kapható 0,1%-os gentamicin kenőcsöt naponta háromszor alkalmazzuk Tegaderm elzáródás mellett két héten keresztül a megcélzott RDEB bőrerózióra. Hasonló méretű RDEB erózióra is alkalmazzuk a kenőcskontroll hordozót naponta háromszor. Ez az adagolási rend a CF-betegeken végzett sikeres klinikai vizsgálaton alapul, amely mellékhatások nélküli klinikai hatékonyságot eredményezett.19 In vitro sejttenyésztési vizsgálataink során kimutattuk, hogy a gentamicin egyetlen dózisa (400 ug/ml) a normál sejtekben tapasztalt szint 20-40%-ában indukálta a C7 expressziót (1A és 1B ábra).23 Klinikai vizsgálatunkban a kísérleti kenőcs 1 milligramm gentamicint tartalmaz egy milliliter kenőcs-vivőanyagban.

Gentamicin befecskendezése az RDEB-beteg bőrének magas dermisába: Ezen túlmenően azonosítjuk a 2,0 cm x 2,0 cm-es sértetlen, ép bőr célterületeit a hólyagképződésre hajlamos területeken, és intradermálisan beadjuk a kereskedelemben kapható steril gentamicin oldatot (40 mg/ml sóoldatban). ). Hasonló kontrollterületre azonos térfogatú sóoldatot fecskendeznek be. 200 ul-t (8 milligrammot) fecskendezünk be minden helyre egyszer a 0. napon és még egyszer az 1. napon. Mind a két napon egyetlen injekciót kell beadni a helyre. A teljes dózis 16 milligramm, amelyet a dermisz felső részébe fecskendeznek be, ahol az érintkezésbe kerül a páciens dermális fibroblasztjaival és bazális keratinocitáival. Publikált in vitro átolvasási vizsgálatunkban minden 1 cm2 tenyésztett sejtet 400 ug/ml gentamicin hatásának tettünk ki, amely átolvasási aktivitást mutatott citoxocity nélkül. A javasolt intradermális vizsgálathoz az in vitro dózisnál körülbelül ötször nagyobb összdózist alkalmazunk.

Kezdeti és nyomon követési paraméterek: Bármilyen kezelés előtt az RDEB betegeket 9 mm-es borotválkozási biopsziának vetik alá az ép bőrről, amelyet 3 részre osztanak, és értékelik a H&E hisztológiát, transzmissziós elektronmikroszkópiát és közvetlen immunfluoreszcenciát a C7 expresszió szempontjából. RDEB eróziók vagy ép bőr gentamicin kezelés után 1 és 3 hónappal a hólyagokra hajlamos területeken biopsziát veszünk a kezelt helyeken, és megismételjük a szövettani, ultrastrukturális és C7 expressziós értékeléseket. A DEJ-ben a C7 expressziójának immunfluoreszcenciával (IF) történő értékeléséhez 5 mikronos kriometszeteket vizsgálunk meg a C7 NC1 és NC2 doménjei elleni anti-C7 poliklonális antitestekkel. A C7 NC2 doménjének megnövekedett expressziója a gentamicinnel kezelt bőr vagy eróziók DEJ-jénél az egyik fő "mérföldkő" lesz ebben a tanulmányban, mivel ez a PTC átolvasását és a teljes hosszúságú C7 helyreállítását jelzi. A biopszia harmadik részét ultrastrukturálisan értékelik, és az AF-eket számítógéppel segített morfometriával számba veszik. Ezek a vizsgálatok azt értékelik, hogy a normál AF-ek helyreálltak-e. A normál emberi alanyok bőrmetszetei pozitív kontrollként, míg a vivőanyag kontroll helyéről származó bőrmetszetek negatív kontrollként szolgálnak.

A betegek klinikai értékelése: Bőreróziós helyek: A betegeket megvakítják a kísérleti és kontrollhelyi gentamicin- és vivőanyag-kezelésekkel szemben. A betegek minden héten felmérik a helyeket, és besorolják gyógyulásukat az alábbiak szerint: - 1 = az erózió megnagyobbodása a kezdeti mérethez képest; 0 = nincs változás az erózió méretében; +1 = részleges gyógyulás és a kezdeti méreténél kisebb erózió, +2 = a seb teljes lezárása.

Másodszor, az eróziókról alapfényképeket készítenek, és számítógéppel segített planimetriával kiszámítják az eróziók területét. A kezelés után 1 és 3 hónappal azonos értékeléseket végeznek. Ezért ennek a tanulmánynak a második "mérföldköve" a gentamicinnel kezelt eróziók kisebb felülete lesz, összehasonlítva a vivőanyaggal kezelt eróziókkal.

Intradermális gentamicin injekcióval kezelt RDEB ép bőr értékelése: A betegek és a vizsgálók vakok lesznek a Kísérleti Terület és a Kontroll Terület kezeléseire. A páciens minden héten értékeli a területeket, és az alábbiak szerint osztályozza azokat: - 1 = új hólyag vagy erózió képződése a területen, és +1 = nincs új hólyag vagy erózió. Az 1 és 3 hónapos USC viziteknél biopsziát vesznek a helyekről, és a fentiek szerint értékelik a C7 expresszióját a DEJ-ben és az AF-ek számbavételét.

A betegek biztonságának értékelése: A betegek a kezelés előtti 0. napon és az 1. napon (egy nappal a kezelés után), majd az 1. és 3. napon áttekintik a betegek kiindulási anamnézisét, áttekintik a rendszereket (ROS), életjeleket (beleértve a testsúlyt is) és fizikális vizsgálatokat végeznek. hónapokig az USC-ben tett látogatásaik során. Ugyanebben az időpontban vérvizsgálatokat végeznek, amelyek magukban foglalják a teljes vérképet, az elektrolitokat, a májenzimeket, az eritrociták ülepedési sebességét, a kreatinint és a BUN-t. A kreatinin-clearance-eket is kiszámítják, és a páciens kezelési helyeit kiértékelik bőrpír, ödéma, hólyagosodás és erózió szempontjából. A kezelést követő 0. napon, 1 hónappal és 3 hónappal audiometriás értékelést végeznek. A betegek naponta töltenek ki egy ROS-kérdőívet otthon, és hetente telefonálnak az USC-vizsgálat egyik tagja, aki érdeklődik az új jelekről, tünetekről vagy a ROS-változásokról.

E. A gentamicin-indukált C7-re adott immunválaszok jellemzése: Vizsgált pácienseink mindegyike alacsonyabb szintű C7-et expresszál, beleértve az NC1 domént is, amely a C7 legantigénikusabb doménje. Ezért a B beteg kivételével kételkedünk abban, hogy a páciens PTC-jének leolvasása olyan fehérjét indukál, amelyet a páciens immunrendszere antigénnek tekint. Mindazonáltal reméljük, hogy a gentamicin működőképes, nem pedig nem funkcionális C7-fajtát fog létrehozni. Annak értékelésére, hogy ez a változás kivált-e immunválaszt és termel-e anti-C7 antitesteket, a beteg szérumát a kiinduláskor, 1 hónap és 3 hónap elteltével gyűjtik az anti-C7 antitestek só-hasított IIF és ELISA vizsgálatához. Ha egy páciensben C7 elleni antitestek képződnek, akkor DIF-felméréssel megvizsgáljuk a bőrét C7 antitest-lerakódások szempontjából.