Gentamicinetherapie voor patiënten met recessieve dystrofische epidermolysis bullosa (RDEB) onzinmutatie

Evalueer C7- en AF-expressie met topische en intradermale behandeling met gentamicine Plaatselijke toepassing van gentamicine op huidlaesie: We zullen gedurende twee weken driemaal daags onder Tegaderm-occlusie in de handel verkrijgbare gentamicine 0,1% zalf aanbrengen op een beoogde RDEB-huiderosie. Evenzo zullen we het zalfcontrolevehikel drie keer per dag aanbrengen op een RDEB-erosie van vergelijkbare grootte. Dit doseringsschema is gebaseerd op de succesvolle klinische studie bij CF-patiënten die resulteerde in klinische werkzaamheid zonder bijwerkingen.19 In onze in vitro celkweekstudies hebben we aangetoond dat een enkele dosis gentamicine (400 µg/ml) C7-expressie induceerde op een niveau van 20-40% van dat wat wordt gezien in normale cellen (Figuur 1A en 1B).23 In onze klinische proef bevat de experimentele zalf 1 milligram gentamicine per milliliter zalfdrager.

Injectie van gentamicine in de hoge dermis van de huid van de RDEB-patiënt: daarnaast zullen we doelgebieden van 2,0 cm x 2,0 cm van niet-gewonde intacte huid identificeren binnen gebieden die gevoelig zijn voor blaarvorming en intradermaal in de handel verkrijgbare steriele gentamicine-oplossing injecteren (40 mg/ml in zoutoplossing). ). Een vergelijkbaar controlegebied zal worden geïnjecteerd met gelijke hoeveelheden zoutoplossing. We injecteren eenmaal op dag 0 200 µl (8 milligram) in elke plaats en nogmaals op dag 1. Op elk van de twee dagen zal een enkele injectie op de plaats worden toegediend. De totale dosis zal 16 milligram zijn, geïnjecteerd in de bovenste dermis, waar het in contact zal komen met de dermale fibroblasten en basale keratinocyten van de patiënt. In onze gepubliceerde in vitro read-through-studie werd elke 1 cm2 gekweekte cellen blootgesteld aan 400 µg/ml gentamicine die read-through-activiteit vertoonde zonder cytoxocity. Voor de voorgestelde intradermale studie zullen we een totale dosis gebruiken die ongeveer 5 maal hoger is dan de in vitro dosis.

Initiële en follow-upparameters: Voorafgaand aan elke behandeling zullen de RDEB-patiënten worden onderworpen aan een scheerbiopsie van 9 mm van de intacte huid die in 3 delen zal worden verdeeld en zal worden beoordeeld op H&E-histologie, transmissie-elektronenmicroscopie en directe immunofluorescentie voor C7-expressie. 1 en 3 maanden na behandeling met gentamicine van RDEB-erosies of intacte huid in gebieden die gevoelig zijn voor blaren, nemen we een biopsie van de behandelde plaatsen en herhalen we de histologische, ultrastructurele en C7-expressie-evaluaties. Voor de beoordeling van C7-expressie op de DEJ door middel van immunofluorescentie (IF), zullen 5 micron cryosecties worden onderzocht met anti-C7 polyklonale antilichamen tegen de NC1- en NC2-domeinen van C7. De verhoogde expressie van het NC2-domein van C7 bij de DEJ van met gentamicine behandelde huid of erosies zal dienen als een belangrijke "mijlpaal" in deze studie, aangezien het zou duiden op PTC-doorlezing en herstel van een volledige C7. Het derde deel van de biopsie zal ultrastructureel worden geëvalueerd en AF's zullen worden opgesomd door computerondersteunde morfometrie. Deze onderzoeken zullen beoordelen of er herstel is van normale AF's. Huidcoupes van normale menselijke proefpersonen dienen als positieve controles, terwijl huidcoupes van de voertuigcontroleplaats als negatieve controles dienen.

Klinische beoordeling van de patiënt: Huiderosieplaatsen: patiënten zullen blind zijn voor de behandelingen met gentamicine en vehiculum van de proefplaats en de controleplaats. Elke week zullen de patiënten de plaatsen beoordelen en hun genezing als volgt beoordelen: - 1 = vergroting van de erosie in vergelijking met de oorspronkelijke grootte; 0 = geen verandering in de grootte van de erosie; +1 = gedeeltelijke genezing en een kleinere erosie dan de oorspronkelijke grootte, en +2 = volledige sluiting van de wond.

Ten tweede zullen basislijnfoto's van de erosies worden gegenereerd en de oppervlakte van de erosies zal worden berekend door middel van computerondersteunde planimetrie. Identieke beoordelingen zullen worden gemaakt op 1 en 3 maanden na de behandeling. Daarom zal een tweede "mijlpaal" voor deze studie de verkleinde oppervlakten van met gentamicine behandelde erosies zijn in vergelijking met met voertuigcontrole behandelde erosies.

Evaluatie van RDEB-intacte huid behandeld met intradermale injecties van gentamicine: patiënten en onderzoekers zullen blind zijn voor de behandelingen van het experimentele gebied en het controlegebied. Elke week beoordeelt de patiënt de gebieden en beoordeelt ze als volgt: - 1 = nieuwe blaarvorming of erosievorming op de plaats en +1 = geen nieuwe blaren of erosievorming. Bij USC-bezoeken na 1 en 3 maanden zullen biopsieën worden verkregen van de locaties en zoals hierboven worden geëvalueerd voor de expressie van C7 bij de DEJ en opsomming van AF's.

Evaluatie van de veiligheid van de patiënt: patiënten krijgen een basisgeschiedenis, beoordeling van systemen (ROS), vitale functies (inclusief gewicht) en lichamelijk onderzoek op dag 0 vóór de behandeling, en op dag 1 (een dag na de behandeling) en vervolgens op dag 1 en 3 maanden tijdens hun bezoeken aan het USC. Op dezelfde tijdstippen zullen bloedonderzoeken worden uitgevoerd en een volledig bloedbeeld, elektrolyten, leverenzymen, bezinkingssnelheid van erytrocyten, creatinine en BUN omvatten. Creatinineklaringen worden ook berekend en de behandelingsplaatsen van de patiënt worden beoordeeld op erytheem, oedeem, blaarvorming en erosies. Op dag 0, 1 maand en 3 maanden na de behandeling worden audiometrische evaluaties uitgevoerd. Patiënten vullen dagelijks thuis een ROS-vragenlijst in en worden wekelijks gebeld door een USC-onderzoekslid met vragen over nieuwe tekenen, symptomen of ROS-veranderingen.

E. Karakterisering van immuunresponsen op door gentamicine geïnduceerd C7: Onze studiepatiënten brengen allemaal lagere niveaus van C7 tot expressie, inclusief het NC1-domein, dat het meest antigene domein van C7 is. Daarom betwijfelen we, met uitzondering van patiënt B, of het lezen van de PTC van de patiënt een eiwit zal induceren dat door het immuunsysteem van de patiënt als antigeen wordt beschouwd. Desalniettemin hopen we dat gentamicine een functionele, in plaats van een niet-functionele soort C7 zal genereren. Om te evalueren of deze verandering een immuunrespons teweegbrengt en anti-C7-antilichamen genereert, zal serum van de patiënt worden verkregen bij baseline, 1 maand en 3 maanden voor evaluatie van anti-C7-antilichamen door middel van salt-split IIF en ELISA. Als een patiënt antilichamen tegen C7 ontwikkelt, onderzoeken we de huid op afzettingen van C7-antilichamen door middel van DIF.