Thérapie à la gentamicine pour les patients atteints d'épidermolyse bulleuse dystrophique récessive (EBDR) présentant une mutation non-sens

Évaluer l'expression de C7 et AF avec un traitement topique et intradermique à la gentamicine Application topique de gentamicine sur la lésion cutanée : nous appliquerons une pommade à la gentamicine à 0,1 % disponible dans le commerce trois fois par jour sous occlusion Tegaderm pendant deux semaines sur une érosion cutanée RDEB cible. De même, nous appliquerons le véhicule de contrôle de la pommade trois fois par jour sur une érosion RDEB de taille similaire. Ce schéma posologique est basé sur l'essai clinique réussi chez des patients atteints de mucoviscidose qui a abouti à une efficacité clinique sans effets secondaires.19 Dans nos études de culture cellulaire in vitro, nous avons montré qu'une dose unique de gentamicine (400 ug/ml) induisait l'expression de C7 à un niveau de 20 à 40 % de celui observé dans les cellules normales (Figure 1A et 1B).23 Dans notre essai clinique, la pommade expérimentale contiendra 1 milligramme de gentamicine par millilitre de véhicule de pommade.

Injection de gentamicine dans le derme supérieur de la peau du patient RDEB : De plus, nous identifierons des zones cibles de 2,0 cm x 2,0 cm de peau intacte non blessée dans les zones sujettes à la formation de cloques et nous injecterons par voie intradermique une solution de gentamicine stérile disponible dans le commerce (40 mg/ml dans une solution saline ). Une zone de contrôle similaire sera injectée avec des volumes égaux de solution saline. Nous injecterons 200 ul (8 milligrammes) dans chaque site une fois le jour 0 et une fois de plus le jour 1. Une seule injection sera administrée au site à chacun des deux jours. La dose totale sera de 16 milligrammes injectés dans le derme supérieur où il entrera en contact avec les fibroblastes dermiques et les kératinocytes basaux du patient. Dans notre étude de lecture in vitro publiée, chaque 1 cm2 de cellules cultivées a été exposé à 400 ug/ml de gentamicine qui a montré une activité de lecture sans cytoxocité. Pour l'étude intradermique proposée, nous utiliserons une dose totale environ 5 fois supérieure à la dose in vitro.

Paramètres initiaux et de suivi : Avant tout traitement, les patients RDEB seront soumis à une biopsie de 9 mm de peau intacte qui sera divisée en 3 parties et évaluée pour l'histologie H&E, la microscopie électronique à transmission et l'immunofluorescence directe pour l'expression de C7. 1 et 3 mois après le traitement à la gentamicine des érosions RDEB ou de la peau intacte dans les zones sujettes aux cloques, nous effectuerons une biopsie des sites traités et répéterons les évaluations histologiques, ultrastructurales et d'expression de C7. Pour l'évaluation de l'expression de C7 au DEJ par immunofluorescence (IF), des cryosections de 5 microns seront sondées avec des anticorps polyclonaux anti-C7 dirigés contre les domaines NC1 et NC2 de C7. L'expression accrue du domaine NC2 de C7 au DEJ de la peau ou des érosions traitées à la gentamicine servira d'« étape » majeure dans cette étude, car elle indiquerait la lecture PTC et la restauration d'un C7 complet. La troisième partie de la biopsie sera évaluée de manière ultrastructurale et les FA seront dénombrées par morphométrie assistée par ordinateur. Ces études évalueront s'il y a restauration des FA normales. Des coupes de peau de sujets humains normaux serviront de témoins positifs, tandis que des coupes de peau provenant du site de contrôle du véhicule serviront de témoins négatifs.

Évaluation clinique du patient : sites d'érosion cutanée : les patients ne seront pas informés des traitements à la gentamicine et au véhicule du site expérimental et du site de contrôle. Chaque semaine, les patients évalueront les sites et noteront leur cicatrisation comme suit : - 1 = élargissement de l'érosion par rapport à sa taille initiale ; 0 = aucun changement dans la taille de l'érosion ; +1 = cicatrisation partielle et une érosion inférieure à sa taille initiale, et +2 = fermeture complète de la plaie.

Dans un deuxième temps, des photographies de référence des érosions seront générées et la surface des érosions calculée par planimétrie assistée par ordinateur. Des évaluations identiques seront faites à 1 et 3 mois après le traitement. Par conséquent, une deuxième "étape importante" pour cette étude sera une diminution des surfaces des érosions traitées à la gentamicine par rapport aux érosions traitées par le véhicule témoin.

Évaluation de la peau intacte RDEB traitée par des injections intradermiques de gentamicine : les patients et les enquêteurs seront aveuglés aux traitements de la zone expérimentale et de la zone de contrôle. Chaque semaine, le patient évaluera les zones et les classera comme suit : - 1 = formation de nouvelles cloques ou érosions sur le site, et +1 = pas de nouvelles cloques ou érosions. Lors des visites USC à 1 et 3 mois, des biopsies seront obtenues à partir des sites et évaluées comme ci-dessus pour l'expression de C7 au DEJ et le dénombrement des AF.

Évaluation de la sécurité des patients : les patients auront des antécédents de base, un examen des systèmes (ROS), des signes vitaux (y compris le poids) et des examens physiques au jour 0 avant le traitement, et au jour 1 (un jour après le traitement), puis aux jours 1 et 3. mois lors de leurs visites à l'USC. À ces mêmes moments, des tests sanguins seront effectués et comprendront une numération globulaire complète, les électrolytes, les enzymes hépatiques, la vitesse de sédimentation des érythrocytes, la créatinine et l'azote uréique. Les clairances de la créatinine seront également calculées et les sites de traitement du patient seront évalués pour l'érythème, l'œdème, les cloques et les érosions. Au jour 0, 1 mois et 3 mois après le traitement, des évaluations audiométriques seront effectuées. Les patients rempliront quotidiennement un questionnaire ROS à domicile et seront téléphonés chaque semaine par un membre de l'étude de l'USC pour s'enquérir de tout nouveau signe, symptôme ou changement de ROS.

E. Caractérisation des réponses immunitaires au C7 induit par la gentamicine : les patients de notre étude expriment tous des niveaux inférieurs de C7, y compris le domaine NC1, qui est le domaine le plus antigénique de C7. Par conséquent, à l'exception du patient B, nous doutons que la lecture à travers le PTC du patient induise une protéine considérée comme antigénique par le système immunitaire du patient. Néanmoins, nous espérons que la gentamicine générera une espèce fonctionnelle plutôt que non fonctionnelle de C7. Pour évaluer si ce changement déclenche une réponse immunitaire et génère des anticorps anti-C7, le sérum du patient sera obtenu au départ, 1 mois et 3 mois pour l'évaluation des anticorps anti-C7 par sel-split IIF et ELISA. Si un patient développe des anticorps anti-C7, nous examinerons ensuite sa peau à la recherche de dépôts d'anticorps anti-C7 par DIF.