Terapia con gentamicina para pacientes con mutación sin sentido de epidermólisis ampollosa distrófica recesiva (RDEB)

Evaluar la expresión de C7 y AF con tratamiento de gentamicina tópica e intradérmica Aplicación tópica de gentamicina a la lesión de la piel: Aplicaremos un ungüento de gentamicina al 0,1 % disponible en el mercado tres veces al día bajo oclusión de Tegaderm durante dos semanas a una erosión de la piel RDEB objetivo. Asimismo, aplicaremos el vehículo de control de pomada tres veces al día a una erosión RDEB de tamaño similar. Este programa de dosificación se basa en el ensayo clínico exitoso en pacientes con FQ que resultó en una eficacia clínica sin efectos secundarios.19 En nuestros estudios de cultivos celulares in vitro, demostramos que una sola dosis de gentamicina (400 ug/ml) inducía la expresión de C7 a un nivel del 20-40 % del observado en células normales (Figura 1A y 1B).23 En nuestro ensayo clínico, la pomada experimental contendrá 1 miligramo de gentamicina por mililitro de vehículo de pomada.

Inyección de gentamicina en la dermis alta de la piel del paciente con RDEB: Además, identificaremos áreas diana de 2,0 cm x 2,0 cm de piel intacta sin heridas dentro de áreas propensas a la formación de ampollas e inyectaremos por vía intradérmica solución de gentamicina estéril disponible en el mercado (40 mg/ml en solución salina). ). Se inyectará un área de control similar con volúmenes iguales de solución salina. Inyectaremos 200 ul (8 miligramos) en cada sitio una vez el día 0 y otra vez el día 1. Se administrará una sola inyección en el sitio cada uno de los dos días. La dosis total será de 16 miligramos inyectados en la dermis superior donde entrará en contacto con los fibroblastos dérmicos y los queratinocitos basales del paciente. En nuestro estudio de lectura in vitro publicado, cada 1 cm2 de células cultivadas se expuso a 400 ug/ml de gentamicina que mostró actividad de lectura sin citoxicidad. Para el estudio intradérmico propuesto, utilizaremos una dosis total de aproximadamente 5 veces mayor que la dosis in vitro.

Parámetros iniciales y de seguimiento: antes de cualquier tratamiento, los pacientes con RDEB se someterán a una biopsia por raspado de piel intacta de 9 mm que se dividirá en 3 partes y se evaluará para histología de H&E, microscopía electrónica de transmisión e inmunofluorescencia directa para expresión de C7. 1 y 3 meses después del tratamiento con gentamicina de las erosiones de RDEB o piel intacta en áreas propensas a ampollas, realizaremos una biopsia de los sitios tratados y repetiremos las evaluaciones histológicas, ultraestructurales y de expresión de C7. Para la evaluación de la expresión de C7 en el DEJ mediante inmunofluorescencia (IF), se sondearán criosecciones de 5 micras con anticuerpos policlonales anti-C7 contra los dominios NC1 y NC2 de C7. El aumento de la expresión del dominio NC2 de C7 en el DEJ de piel o erosiones tratadas con gentamicina servirá como un "hito" importante en este estudio, ya que indicaría la lectura completa de PTC y la restauración de un C7 de longitud completa. La tercera parte de la biopsia se evaluará ultraestructuralmente y las FA se enumerarán mediante morfometría asistida por computadora. Estos estudios evaluarán si hay restauración de las FA normales. Las secciones de piel de sujetos humanos normales servirán como controles positivos, mientras que las secciones de piel del sitio de control del vehículo servirán como controles negativos.

Evaluación clínica del paciente: Sitios de erosión de la piel: Los pacientes no conocerán los tratamientos con gentamicina y vehículo del Sitio experimental y el Sitio de control. Cada semana, los pacientes evaluarán los sitios y clasificarán su curación de la siguiente manera: - 1 = agrandamiento de la erosión en comparación con su tamaño inicial; 0 = sin cambios en el tamaño de la erosión; +1 = cicatrización parcial y una erosión menor que su tamaño inicial, y +2 = cierre completo de la herida.

En segundo lugar, se generarán fotografías de referencia de las erosiones y se calculará el área de las erosiones mediante planimetría asistida por computadora. Se realizarán evaluaciones idénticas 1 y 3 meses después del tratamiento. Por lo tanto, un segundo "hito" para este estudio será la disminución de las áreas superficiales de las erosiones tratadas con gentamicina en comparación con las erosiones tratadas con el control del vehículo.

Evaluación de la piel intacta con RDEB tratada con inyecciones intradérmicas de gentamicina: los pacientes y los investigadores no conocerán los tratamientos del Área Experimental y el Área de Control. Cada semana, el paciente evaluará las áreas y las calificará de la siguiente manera: - 1 = formación de nuevas ampollas o erosión en el sitio, y +1 = sin nuevas ampollas o erosiones. En las visitas de USC a los meses 1 y 3, se obtendrán biopsias de los sitios y se evaluarán como se indicó anteriormente para la expresión de C7 en el DEJ y la enumeración de AF.

Evaluación de la seguridad de los pacientes: los pacientes tendrán antecedentes, revisión de sistemas (ROS), signos vitales (incluido el peso) y exámenes físicos el Día 0 antes del tratamiento, y el Día 1 (un día después del tratamiento) y luego el 1 y el 3 meses durante sus visitas a la USC. En estos mismos momentos, se realizarán análisis de sangre que incluirán un hemograma completo, electrolitos, enzimas hepáticas, tasa de sedimentación de eritrocitos, creatinina y BUN. También se calcularán las depuraciones de creatinina y se evaluarán los sitios de tratamiento del paciente en busca de eritema, edema, ampollas y erosiones. En el Día 0, 1 mes y 3 meses después del tratamiento, se realizarán evaluaciones de audiometría. Los pacientes completarán un cuestionario de ROS diariamente en casa y un miembro del estudio de la USC los llamará por teléfono semanalmente para preguntarles sobre cualquier nuevo signo, síntoma o cambio de ROS.

E. Caracterización de las respuestas inmunitarias a C7 inducida por gentamicina: Todos los pacientes de nuestro estudio expresan niveles más bajos de C7, incluido el dominio NC1, que es el dominio más antigénico de C7. Por lo tanto, con la excepción del paciente B, dudamos que la lectura a través del PTC del paciente induzca una proteína que el sistema inmunitario del paciente considere antigénica. Sin embargo, esperamos que la gentamicina genere una especie de C7 funcional, en lugar de no funcional. Para evaluar si este cambio desencadena una respuesta inmunitaria y genera anticuerpos anti-C7, se obtendrá suero del paciente al inicio, 1 mes y 3 meses para la evaluación de anticuerpos anti-C7 mediante IIF de división en sal y ELISA. Si un paciente desarrolla anticuerpos contra C7, examinaremos su piel en busca de depósitos de anticuerpos C7 mediante DIF.