Gentamicinterapi for pasienter med recessiv dystrofisk epidermolysis bullosa (RDEB) nonsense mutasjonspasienter

Evaluer C7- og AF-ekspresjon med topisk og intradermal gentamicinbehandling. Topisk påføring av gentamicin på hudlesjon: Vi vil påføre kommersielt tilgjengelig gentamicin 0,1 % salve tre ganger daglig under Tegaderm-okklusjon i to uker for en målrettet RDEB-huderosjon. På samme måte vil vi påføre salvekontrollkjøretøyet tre ganger om dagen på en lignende størrelse RDEB-erosjon. Denne doseringsplanen er basert på den vellykkede kliniske studien med CF-pasienter som resulterte i klinisk effekt uten bivirkninger.19 I våre in vitro cellekulturstudier viste vi at en enkelt dose gentamicin (400 ug/ml) induserte C7-ekspresjon på et nivå på 20-40 % av det som sees i normale celler (figur 1A og 1B).23 I vår kliniske studie vil den eksperimentelle salven inneholde 1 milligram gentamicin per milliliter salvebærer.

Injeksjon av gentamicin i den høye dermis av RDEB-pasienthud: I tillegg vil vi identifisere målområder på 2,0 cm x 2,0 cm med uskadet intakt hud innenfor områder som er utsatt for blemmedannelse og intradermalt injisere kommersielt tilgjengelig steril gentamicinløsning (40 mg/ml i saltvann). ). Et lignende kontrollområde vil bli injisert med like volum saltvann. Vi injiserer 200 ul (8 milligram) på hvert sted én gang på dag 0 og én gang til på dag 1. En enkelt injeksjon vil bli administrert på stedet på hver av de to dagene. Den totale dosen vil være 16 milligram injisert i den øvre dermis hvor den vil komme i kontakt med pasientens dermale fibroblaster og basale keratinocytter. I vår publiserte in vitro-gjennomlesningsstudie ble hver 1 cm2 dyrkede celler eksponert for 400 ug/ml gentamicin som viste gjennomlesningsaktivitet uten cytoksitet. For den foreslåtte intradermale studien vil vi bruke en totaldose som er omtrent 5 ganger større enn in vitro-dosen.

Initial- og oppfølgingsparametre: Før enhver behandling vil RDEB-pasientene bli utsatt for en 9 mm barberingsbiopsi av intakt hud som deles i 3 deler og evalueres for H&E-histologi, transmisjonselektronmikroskopi og direkte immunfluorescens for C7-ekspresjon. 1 og 3 måneder etter gentamicinbehandling av RDEB-erosjoner eller intakt hud i blemmerutsatte områder, vil vi biopsi de behandlede stedene og gjenta de histologiske, ultrastrukturelle og C7-ekspresjonsevalueringene. For vurdering av C7-ekspresjon ved DEJ ved immunfluorescens (IF), vil 5 mikron kryoseksjoner bli sondert med anti-C7 polyklonale antistoffer mot NC1- og NC2-domenene til C7. Det økte uttrykket av NC2-domenet til C7 ved DEJ av gentamicin-behandlet hud eller erosjoner vil tjene som en viktig "milepæl" i denne studien siden det ville indikere PTC-gjennomlesing og restaurering av en full-lengde C7. Den tredje delen av biopsien vil bli evaluert ultrastrukturelt, og AF-er vil bli oppregnet ved hjelp av datamaskinassistert morfometri. Disse studiene vil vurdere om det er gjenoppretting av normale AF. Hudseksjoner fra normale mennesker vil tjene som positive kontroller, mens hudseksjoner fra kjøretøykontrollstedet vil tjene som negative kontroller.

Pasientens kliniske vurdering: Huderosjonssteder: Pasientene vil bli blindet for gentamicin- og vehikelbehandlinger på det eksperimentelle stedet og kontrollstedet. Hver uke vil pasientene vurdere stedene og gradere deres helbredelse som følger: - 1 = forstørrelse av erosjonen sammenlignet med dens opprinnelige størrelse; 0 = ingen endring i størrelsen på erosjonen; +1 = delvis tilheling og en mindre erosjon enn dens opprinnelige størrelse, og +2 = fullstendig lukking av såret.

For det andre vil grunnlinjebilder av erosjonene bli generert og arealet av erosjonene beregnet ved hjelp av datamaskinassistert planimetri. Identiske vurderinger vil bli gjort 1 og 3 måneder etter behandling. Derfor vil en andre "milepæl" for denne studien være reduserte overflatearealer av gentamicinbehandlede erosjoner sammenlignet med vehikelkontrollbehandlede erosjoner.

Evaluering av RDEB intakt hud behandlet med intradermale injeksjoner av gentamicin: Pasienter og etterforskere vil bli blindet for behandlingene i forsøksområdet og kontrollområdet. Hver uke vil pasienten evaluere områdene og gradere dem som følger: - 1 = ny blemme eller erosjonsdannelse på stedet, og +1 = ingen nye blemmer eller erosjoner. Ved USC-besøk etter 1 og 3 måneder vil biopsier bli innhentet fra stedene og evaluert som ovenfor for uttrykket av C7 ved DEJ og opptelling av AF.

Evaluering av pasientens sikkerhet: Pasienter vil ha baseline-historier, gjennomgang av systemer (ROS), vitale tegn (inkludert vekt) og fysiske undersøkelser på dag 0 før behandling, og på dag 1 (en dag etter behandling) og deretter på 1 og 3 måneder under deres besøk til USC. På disse samme tidspunktene vil blodprøver bli utført og inkluderer en fullstendig blodtelling, elektrolytter, leverenzymer, erytrocyttsedimenteringshastighet, kreatinin og BUN. Kreatininclearances vil også bli beregnet, og pasientens behandlingssteder vil bli evaluert for erytem, ​​ødem, blemmer og erosjoner. På dag 0, 1 måned og 3 måneder etter behandling vil det bli utført audiometrievalueringer. Pasienter vil fylle ut et ROS-spørreskjema daglig hjemme, og bli oppringt ukentlig av et medlem av USC-studien som spør om nye tegn, symptomer eller ROS-endringer.

E. Karakterisering av immunresponser på gentamicin-indusert C7: Våre studiepasienter uttrykker alle lavere nivåer av C7 inkludert NC1-domenet, som er det mest antigene domenet til C7. Derfor, med unntak av pasient B, tviler vi på at å lese gjennom pasientens PTC vil indusere et protein som blir sett på som antigent av pasientens immunsystem. Likevel håper vi at gentamicin vil generere en funksjonell, snarere enn ikke-funksjonell, art av C7. For å evaluere om denne endringen utløser en immunrespons og genererer anti-C7-antistoffer, vil pasientserum bli innhentet ved baseline, 1 måned og 3 måneder for evaluering av anti-C7-antistoffer ved saltdelt IIF og ELISA. Hvis en pasient utvikler antistoffer mot C7, vil vi undersøke huden deres for C7-antistoffavleiringer fra DIF.