Gentamicinterapi til patienter med recessiv dystrofisk epidermolysis bullosa (RDEB) nonsensmutationspatienter

Evaluer C7- og AF-ekspression med topisk og intradermal gentamicinbehandling Topisk påføring af gentamicin på hudlæsioner: Vi vil anvende kommercielt tilgængelig gentamicin 0,1 % salve tre gange dagligt under Tegaderm-okklusion i to uger til en målrettet RDEB-huderosion. Ligeledes vil vi anvende salvekontrolmidlet tre gange om dagen på en lignende størrelse RDEB-erosion. Denne doseringsplan er baseret på det vellykkede kliniske forsøg med CF-patienter, der resulterede i klinisk effekt uden bivirkninger.19 I vores in vitro cellekulturundersøgelser viste vi, at en enkelt dosis gentamicin (400 ug/ml) inducerede C7-ekspression i et niveau på 20-40 % af det, der ses i normale celler (figur 1A og 1B).23 I vores kliniske forsøg vil den eksperimentelle salve indeholde 1 milligram gentamicin pr. milliliter salvebærer.

Injektion af gentamicin i den høje dermis af RDEB-patients hud: Derudover vil vi identificere målområder på 2,0 cm x 2,0 cm af uskadet intakt hud inden for områder, der er tilbøjelige til blæredannelse, og intradermalt injicere kommercielt tilgængelig steril gentamicinopløsning (40 mg/ml i saltvand). ). Et lignende kontrolområde vil blive injiceret med lige store mængder saltvand. Vi injicerer 200 ul (8 milligram) på hvert sted én gang på dag 0 og igen på dag 1. En enkelt injektion vil blive givet til stedet på hver af de to dage. Den samlede dosis vil være 16 milligram injiceret i den øvre dermis, hvor den vil komme i kontakt med patientens dermale fibroblaster og basale keratinocytter. I vores publicerede in vitro-gennemlæsningsundersøgelse blev hver 1 cm2 dyrkede celler udsat for 400 ug/ml gentamicin, der viste gennemlæsningsaktivitet uden cytoxocitet. Til den foreslåede intradermale undersøgelse vil vi bruge en samlet dosis, der er cirka 5 gange større end in vitro-dosis.

Indledende og opfølgningsparametre: Forud for enhver behandling vil RDEB-patienterne blive udsat for en 9 mm barberingsbiopsi af intakt hud, der vil blive opdelt i 3 dele og evalueret for H&E histologi, transmissionselektronmikroskopi og direkte immunfluorescens for C7-ekspression. 1 og 3 måneder efter gentamicinbehandling af RDEB-erosioner eller intakt hud i blæretilbøjelige områder, vil vi biopsiere de behandlede steder og gentage de histologiske, ultrastrukturelle og C7-ekspressionsevalueringer. Til vurdering af C7-ekspression ved DEJ ved immunfluorescens (IF) vil 5 mikron kryosnit blive probet med anti-C7 polyklonale antistoffer mod NC1- og NC2-domænerne i C7. Den øgede ekspression af NC2-domænet af C7 ved DEJ af gentamicin-behandlet hud eller erosioner vil tjene som en stor "milepæl" i denne undersøgelse, da det ville indikere PTC-gennemlæsning og restaurering af en fuldlængde C7. Den tredje del af biopsien vil blive evalueret ultrastrukturelt, og AF'er vil blive opregnet ved computer-assisteret morfometri. Disse undersøgelser vil vurdere, om der er genoprettelse af normale AF'er. Hudsnit fra normale mennesker vil tjene som positive kontroller, mens hudsnit fra vehikelkontrolstedet vil tjene som negative kontroller.

Patientens kliniske vurdering: Huderosionssteder: Patienterne vil blive blindet over for gentamicin- og vehikelbehandlingerne på det eksperimentelle sted og kontrolstedet. Hver uge vil patienterne vurdere stederne og gradere deres heling som følger: - 1 = forstørrelse af erosionen sammenlignet med dens oprindelige størrelse; 0 = ingen ændring i størrelsen af ​​erosionen; +1 = delvis heling og en mindre erosion end dens oprindelige størrelse, og +2 = fuldstændig lukning af såret.

For det andet vil der blive genereret baseline fotografier af erosionerne og arealet af erosionerne beregnet ved computerassisteret planimetri. Identiske vurderinger vil blive foretaget 1 og 3 måneder efter behandlingen. Derfor vil en anden "milepæl" for denne undersøgelse være reducerede overfladearealer af gentamicin-behandlede erosioner sammenlignet med vehikelkontrolbehandlede erosioner.

Evaluering af RDEB intakt hud behandlet ved intradermale injektioner af gentamicin: Patienter og efterforskere vil blive blindet for behandlingerne i forsøgsområdet og kontrolområdet. Hver uge vil patienten evaluere områderne og klassificere dem som følger: - 1 = ny blære eller erosionsdannelse på stedet, og +1 = ingen nye blærer eller erosioner. Ved USC-besøg efter 1 og 3 måneder vil der blive opnået biopsier fra stederne og evalueret som ovenfor for ekspression af C7 ved DEJ og optælling af AF'er.

Evaluering af patienternes sikkerhed: Patienterne vil have baseline historier, gennemgang af systemer (ROS), vitale tegn (inklusive vægt) og fysiske undersøgelser på dag 0 før behandling og på dag 1 (en dag efter behandling) og derefter på 1 og 3 måneder under deres besøg på USC. På disse samme tidspunkter vil der blive udført blodprøver og inkluderer en komplet blodtælling, elektrolytter, leverenzymer, erytrocytsedimentationshastighed, kreatinin og BUN. Kreatininclearance vil også blive beregnet, og patientens behandlingssteder vil blive evalueret for erytem, ​​ødem, blærer og erosioner. På dag 0, 1 måned og 3 måneder efter behandlingen vil der blive foretaget audiometrievalueringer. Patienterne vil udfylde et ROS-spørgeskema dagligt derhjemme og blive ringet op ugentligt af et USC-studiemedlem, der spørger om eventuelle nye tegn, symptomer eller ROS-ændringer.

E. Karakterisering af immunresponser på gentamicin-induceret C7: Vores undersøgelsespatienter udtrykker alle lavere niveauer af C7 inklusive NC1-domænet, som er det mest antigene domæne af C7. Med undtagelse af patient B tvivler vi derfor på, at gennemlæsning af patientens PTC vil inducere et protein, der ses som antigent af patientens immunsystem. Ikke desto mindre håber vi, at gentamicin vil generere en funktionel, snarere end ikke-funktionel, art af C7. For at vurdere, om denne ændring udløser et immunrespons og genererer anti-C7-antistoffer, vil patientserum blive opnået ved baseline, 1 måned og 3 måneder til evaluering af anti-C7-antistoffer ved salt-split IIF og ELISA. Hvis en patient udvikler antistoffer mod C7, vil vi derefter undersøge deres hud for C7-antistofaflejringer fra DIF.