Terapia gentamycyną u pacjentów z mutacją nonsensowną z dystroficzną dystroficzną epidermolizą naskórka (RDEB)

Ocena ekspresji C7 i AF za pomocą miejscowego i śródskórnego leczenia gentamycyną Miejscowe stosowanie gentamycyny na zmianę skórną: Będziemy aplikować dostępną w handlu 0,1% maść gentamycyny trzy razy dziennie pod okluzją Tegaderm przez dwa tygodnie na docelową erozję skóry RDEB. Podobnie, będziemy nakładać podłoże kontrolne maści trzy razy dziennie na nadżerki RDEB o podobnej wielkości. Ten schemat dawkowania opiera się na udanych próbach klinicznych na pacjentach z mukowiscydozą, które dały skuteczność kliniczną bez skutków ubocznych.19 W naszych badaniach hodowli komórek in vitro wykazaliśmy, że pojedyncza dawka gentamycyny (400 ug/ml) indukowała ekspresję C7 na poziomie 20-40% obserwowanym w normalnych komórkach (ryc. 1A i 1B).23 W naszym badaniu klinicznym eksperymentalna maść będzie zawierała 1 miligram gentamycyny na mililitr nośnika maści.

Wstrzyknięcie gentamycyny w górną warstwę skóry pacjenta z RDEB: Ponadto zidentyfikujemy docelowe obszary nieuszkodzonej nieuszkodzonej skóry o wymiarach 2,0 cm x 2,0 cm w obszarach podatnych na tworzenie się pęcherzy i wstrzykniemy śródskórnie dostępny w handlu sterylny roztwór gentamycyny (40 mg/ml w soli fizjologicznej ). W podobny obszar kontrolny zostaną wstrzyknięte równe objętości soli fizjologicznej. W każde miejsce wstrzykniemy 200 ul (8 miligramów) raz w dniu 0 i ponownie w dniu 1. Każdego z dwóch dni zostanie podane pojedyncze wstrzyknięcie w to miejsce. Całkowita dawka wyniesie 16 miligramów wstrzykiwanych w górną warstwę skóry właściwej, gdzie dojdzie do kontaktu z fibroblastami i keratynocytami podstawnymi skóry pacjenta. W naszym opublikowanym badaniu z odczytem in vitro każdy 1 cm2 hodowanych komórek był wystawiony na działanie 400 ug/ml gentamycyny, która wykazała aktywność odczytu bez cytoksotyczności. W proponowanym badaniu śródskórnym użyjemy dawki całkowitej około 5-krotnie większej niż dawka in vitro.

Parametry początkowe i kontrolne: Przed jakimkolwiek leczeniem pacjenci z RDEB zostaną poddani biopsji nieuszkodzonej skóry o grubości 9 mm, która zostanie podzielona na 3 części i oceniona pod kątem histologii H&E, transmisyjnej mikroskopii elektronowej i bezpośredniej immunofluorescencji pod kątem ekspresji C7. W 1 i 3 miesiące po leczeniu gentamycyną nadżerek RDEB lub nienaruszonej skóry w obszarach podatnych na powstawanie pęcherzy, wykonamy biopsję leczonych miejsc i powtórzymy ocenę histologiczną, ultrastrukturalną i ocenę ekspresji C7. W celu oceny ekspresji C7 w DEJ za pomocą immunofluorescencji (IF), krioskrawki o grubości 5 mikronów będą sondowane przeciwciałami poliklonalnymi anty-C7 skierowanymi przeciwko domenom NC1 i NC2 C7. Zwiększona ekspresja domeny NC2 C7 w DEJ skóry traktowanej gentamycyną lub nadżerek będzie służyć jako jeden z głównych „kamieni milowych” w tym badaniu, ponieważ wskazywałaby na odczyt PTC i przywrócenie pełnej długości C7. Trzecia część biopsji zostanie oceniona ultrastrukturalnie, a AF zostaną zliczone za pomocą morfometrii wspomaganej komputerowo. Badania te pozwolą ocenić, czy następuje przywrócenie normalnych AF. Skrawki skóry pochodzące od zdrowych osobników ludzkich będą służyć jako kontrole pozytywne, podczas gdy skrawki skóry z miejsca kontroli nośnika będą służyć jako kontrole negatywne.

Ocena kliniczna pacjenta: Miejsca nadżerek skórnych: Pacjenci będą zaślepieni na leczenie gentamycyną i podłożem w miejscu eksperymentalnym i kontrolnym. Co tydzień pacjenci oceniają miejsca i oceniają ich gojenie w następujący sposób: - 1 = powiększenie nadżerki w porównaniu z jej początkowym rozmiarem; 0 = brak zmiany rozmiaru erozji; +1 = częściowe wygojenie i nadżerka mniejsza niż jej wielkość początkowa oraz +2 = całkowite zamknięcie rany.

Po drugie, zostaną wygenerowane podstawowe zdjęcia erozji, a powierzchnia erozji zostanie obliczona za pomocą planimetrii wspomaganej komputerowo. Identyczne oceny zostaną przeprowadzone 1 i 3 miesiące po leczeniu. Dlatego drugim „kamieniem milowym” w tym badaniu będzie zmniejszenie powierzchni nadżerek leczonych gentamycyną w porównaniu z nadżerkami leczonymi nośnikiem kontrolnym.

Ocena nieuszkodzonej skóry RDEB leczonej śródskórnymi wstrzyknięciami gentamycyny: Pacjenci i badacze nie będą wiedzieć, jakie zabiegi stosuje się w obszarze doświadczalnym i kontrolnym. Co tydzień pacjent będzie oceniał obszary i oceniał je w następujący sposób: - 1 = powstawanie nowych pęcherzy lub nadżerek w miejscu, oraz +1 = brak nowych pęcherzy lub nadżerek. Podczas wizyt USC po 1 i 3 miesiącach biopsje będą pobierane z miejsc i oceniane jak powyżej pod kątem ekspresji C7 w DEJ i zliczania AF.

Ocena bezpieczeństwa pacjentów: pacjenci będą mieli wyjściową historię, przegląd systemów (ROS), parametry życiowe (w tym wagę) i badania fizykalne w dniu 0 przed leczeniem i w dniu 1 (jeden dzień po leczeniu), a następnie w 1 i 3 miesięcy podczas wizyt w USC. W tych samych punktach czasowych zostaną przeprowadzone badania krwi obejmujące pełną morfologię krwi, elektrolity, enzymy wątrobowe, szybkość sedymentacji erytrocytów, kreatyninę i BUN. Zostaną również obliczone klirensy kreatyniny, a miejsca leczenia pacjenta zostaną ocenione pod kątem rumienia, obrzęku, pęcherzy i nadżerek. W dniu 0, 1 miesiąc i 3 miesiące po leczeniu, zostaną przeprowadzone oceny audiometryczne. Pacjenci będą codziennie wypełniać kwestionariusz ROS w domu i co tydzień dzwonić do nich członek badania USC, pytając o wszelkie nowe oznaki, objawy lub zmiany ROS.

E. Charakterystyka odpowiedzi immunologicznych na indukowany gentamycyną C7: wszyscy nasi badani pacjenci wyrażają niższy poziom C7, w tym domenę NC1, która jest najbardziej antygenową domeną C7. Dlatego, z wyjątkiem pacjenta B, wątpimy, czy odczytanie PTC pacjenta spowoduje indukcję białka, które jest postrzegane jako antygenowe przez układ odpornościowy pacjenta. Niemniej jednak mamy nadzieję, że gentamycyna wygeneruje funkcjonalne, a nie niefunkcjonalne gatunki C7. Aby ocenić, czy ta zmiana wyzwala odpowiedź immunologiczną i wytwarza przeciwciała anty-C7, surowicę pacjenta należy pobrać na początku badania, po 1 miesiącu i 3 miesiącach w celu oceny przeciwciał anty-C7 metodą IIF z rozszczepieniem soli i testem ELISA. Jeśli u pacjenta rozwiną się przeciwciała przeciwko C7, zbadamy jego skórę pod kątem złogów przeciwciał C7 metodą DIF.