Терапия гентамицином у пациентов с рецессивным дистрофическим буллезным эпидермолизом (RDEB) с бессмысленной мутацией

Оцените экспрессию C7 и AF при местном и внутрикожном лечении гентамицином. Местное применение гентамицина при поражении кожи: мы будем применять коммерчески доступную 0,1% мазь гентамицина три раза в день под окклюзией Tegaderm в течение двух недель к целевой эрозии кожи RDEB. Точно так же мы будем наносить мазевой контроль три раза в день на эрозию RDEB аналогичного размера. Этот график дозирования основан на успешном клиническом испытании у пациентов с муковисцидозом, которое показало клиническую эффективность без побочных эффектов.19 В наших исследованиях клеточных культур in vitro мы показали, что однократная доза гентамицина (400 мкг/мл) индуцировала экспрессию С7 на уровне 20-40% от наблюдаемого в нормальных клетках (рис. 1А и 1В).23 В нашем клиническом испытании экспериментальная мазь будет содержать 1 миллиграмм гентамицина на миллилитр мази-носителя.

Инъекция гентамицина в верхнюю дерму кожи пациента с РДЭБ: кроме того, мы определяем целевые участки неповрежденной кожи размером 2,0 см х 2,0 см в областях, склонных к образованию волдырей, и внутрикожно вводим имеющийся в продаже стерильный раствор гентамицина (40 мг/мл в физиологическом растворе). ). В аналогичную контрольную область будут вводиться равные объемы физиологического раствора. Мы будем вводить 200 мкл (8 миллиграммов) в каждый участок один раз в день 0 и еще раз в день 1. Одна инъекция будет вводиться в место в каждый из двух дней. Общая доза будет составлять 16 миллиграммов, вводимых в верхнюю дерму, где она будет контактировать с дермальными фибробластами пациента и базальными кератиноцитами. В нашем опубликованном исследовании считывания in vitro каждый 1 см2 культивируемых клеток подвергался воздействию 400 мкг/мл гентамицина, который проявлял активность считывания без цитоксоцитов. Для предлагаемого внутрикожного исследования мы будем использовать общую дозу, примерно в 5 раз превышающую дозу in vitro.

Исходные и последующие параметры: перед любым лечением у пациентов с РДЭБ будет взята 9-миллиметровая биопсия неповрежденной кожи, которая будет разделена на 3 части и оценена на гистологию H&E, просвечивающую электронную микроскопию и прямую иммунофлуоресценцию на экспрессию C7. Через 1 и 3 месяца после лечения гентамицином эрозий RDEB или неповрежденной кожи в областях, подверженных волдырям, мы проведем биопсию обработанных участков и повторим гистологические, ультраструктурные оценки и оценки экспрессии C7. Для оценки экспрессии C7 в DEJ с помощью иммунофлуоресценции (IF) 5-микронные криосрезы будут исследованы поликлональными антителами против C7 к доменам NC1 и NC2 C7. Повышенная экспрессия домена NC2 C7 в DEJ обработанной гентамицином кожи или эрозий будет служить одной из основных «вех» в этом исследовании, поскольку это будет указывать на считывание PTC и восстановление полноразмерного C7. Третья часть биопсии будет оценена ультраструктурно, а ФП будут подсчитаны с помощью компьютерной морфометрии. Эти исследования оценят, есть ли восстановление нормальной ФП. Срезы кожи нормальных людей будут служить в качестве положительных контролей, тогда как срезы кожи с контрольного участка носителя будут служить в качестве отрицательных контролей.

Клиническая оценка пациентов: Места эрозии кожи: Пациенты не будут осведомлены о лечении гентамицином и носителем в Экспериментальном и Контрольном участках. Каждую неделю пациенты будут оценивать участки и оценивать их заживление следующим образом: - 1 = увеличение эрозии по сравнению с ее первоначальным размером; 0 = размер эрозии не изменился; +1 = частичное заживление и меньший размер эрозии, чем ее первоначальный размер, и +2 = полное закрытие раны.

Во-вторых, будут созданы базовые фотографии эрозий, а площадь эрозий будет рассчитана с помощью компьютерной планиметрии. Идентичные оценки будут сделаны через 1 и 3 месяца после лечения. Следовательно, второй «вехой» для этого исследования будет уменьшение площади поверхности эрозий, обработанных гентамицином, по сравнению с эрозиями, обработанными контрольным носителем.

Оценка интактной кожи RDEB, обработанной внутрикожными инъекциями гентамицина: пациенты и исследователи не будут осведомлены о методах лечения в экспериментальной и контрольной зонах. Каждую неделю пациент будет оценивать области и оценивать их следующим образом: - 1 = образование новых волдырей или эрозий на участке и +1 = отсутствие новых пузырей или эрозий. При посещении USC через 1 и 3 месяца биопсии будут получены из участков и оценены, как указано выше, для экспрессии C7 в DEJ и подсчета AF.

Оценка безопасности пациентов. У пациентов будет исходный анамнез, обзор систем (ROS), основных показателей жизнедеятельности (включая вес) и физические осмотры в день 0 до лечения и в день 1 (через день после лечения), а затем в 1 и 3. месяцев во время их визитов в USC. В эти же моменты времени будут выполняться анализы крови, которые включают общий анализ крови, электролиты, ферменты печени, скорость оседания эритроцитов, креатинин и мочевину. Также будет рассчитан клиренс креатинина, а участки лечения пациента будут оценены на наличие эритемы, отека, пузырей и эрозий. В день 0, через 1 месяц и через 3 месяца после лечения будут проводиться аудиометрические оценки. Пациенты будут ежедневно заполнять анкету ROS дома, и им еженедельно будет звонить участник исследования USC, чтобы узнать о любых новых признаках, симптомах или изменениях ROS.

E. Характеристика иммунных ответов на индуцированный гентамицином C7: все пациенты нашего исследования экспрессируют более низкие уровни C7, включая домен NC1, который является наиболее антигенным доменом C7. Поэтому, за исключением пациента B, мы сомневаемся, что чтение PTC пациента вызовет появление белка, который иммунная система пациента рассматривает как антигенный. Тем не менее, мы надеемся, что гентамицин будет генерировать функциональные, а не нефункциональные виды С7. Чтобы оценить, вызывает ли это изменение иммунный ответ и вырабатывает ли анти-С7 антитела, сыворотка пациента будет получена на исходном уровне, через 1 месяц и 3 месяца для оценки анти-С7 антител с помощью IIF с солевым расщеплением и ELISA. Если у пациента вырабатываются антитела к C7, мы затем исследуем его кожу на наличие отложений антител C7 с помощью DIF.