マスタード患者の気道リモデリング治療のための間葉系幹細胞療法

患者の選択:

この臨床試験では、研究者らはSMに曝露された男性患者におけるMSCの治療効果を検討した。患者はイラン・イラク戦争中にSMに遭遇した記録があった。 患者は研究前にインフォームドコンセントに署名した。 それらは以下の基準に従って選択された：（a）肺損傷の重症度は、中等度の50<1秒努力呼気量（FEV1）<65から重度の40<FEV1<50までの範囲であった。 (b) 禁忌のスパイロメトリーがないこと（喀血、脳動脈瘤または大動脈、肺塞栓症、血圧コントロール不良、最近の気胸、間違いなく手術/胸部の最近の、最近の脳卒中）。 (c) 凝固がないこと。 選択プロセスの除外基準は次のとおりです。 (a) 同時に別の研究に参加している。 (b) 喫煙場所。 (c) 研究中の肺炎の存在。 (d) 輸血反応の発生率。 (e) 他の基礎疾患（心血管疾患、高血圧、糖尿病）。

脂肪由来幹細胞の分離と培養:

200mLの腹部脂肪組織を局所麻酔下で脂肪吸引吸引プロトコルにより採取した。 脂肪吸引物をＰＢＳで洗浄して、組織残骸を除去した。 0.1% w/v コラゲナーゼ A タイプ I を含む 100 mL の PBS を単離組織に添加し、37℃で 60 分間インキュベートしました。 コラゲナーゼ活性は、10% ウシ胎児血清とともに MEM 培地を使用して中和されました。 2000rpmで10分間遠心分離した後、細胞ペレットを培地に再懸濁し、その後培養フラスコに移し、37℃、5%CO2条件で72時間培養しました。 フラスコ内の培地を３日ごとに交換し、細胞を２回継代した。

フローサイトメトリー分析:

細胞表面抗原発現を分析するために、3回目の継代からの5×105個の新鮮な細胞をトリプシン-EDTAによって収集した。 細胞を100gで1分間遠心分離し、染色緩衝液(PBS、2% FBS)に再懸濁し、次いで氷上で10分間インキュベートした。 トリプシンを遠心分離機で中和し、単離した細胞をPBSで2回洗浄し、最後に染色バッファーに再懸濁しました。 細胞を暗環境で30分間インキュベートした。 インキュベーション後、細胞を蛍光色素と結合した抗ヒトモノクローナル抗体 (MAb) で標識しました。 これらの抗体は以下の通りであった：抗ＣＤ９０－フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＣＤ７３－フィコエリトリン（ＰＥ）、ＣＤ１１ｂ－ＦＩＴＣ、ＣＤ３４－ＦＩＴＣ、ＣＤ４４－ＦＩＴＣ、ＣＤ４５－ＰＥ、ＣＤ１０５－ＰＥ。 すべての免疫標識細胞の頻度は、FACS Canto II フローサイトメーターによって分析され、約 500,000 のイベントが評価され、データは FlowJo ソフトウェア (バージョン 10.0) を使用して分析されました。

異常検出のための核型分析:

標準的なギムザ染色手順を実行し、80% コンフルエントな細胞から染色体標本を取得しました。 微小管の形成を停止するために、細胞をコルセミド溶液で処理しました。 次いで、トリプシン-EDTAを使用して有糸分裂停止細胞を回収した。 細胞を抽出し、75 mmol/l KCl に実験室温度で 30 分間浸漬しました。 最後に、それらは遠心分離によって得られた。 上清を固定液と交換し、顕微鏡検査および画像化のために懸濁液をスライド上に広げた。 少なくとも 15 の中期スプレッドが分析されました。 核型は、cytovision ソフトウェアを使用して光学顕微鏡で検討されました。

脂肪由来幹細胞の凍結と保存:

ADMSC を 90% コンフルエンスで採取し、その後凍結のために注射しました。 細胞を収集するために、培地を除去して滅菌PBSに置き換え、3分後にトリプシン-EDTA溶液に置き換えて、37℃で5分間インキュベートしました。 完全培地 (10% FBS を含む MEM) を添加してトリプシンを不活化し、1500 rpm で 5 分間遠心分離しました。 細胞ペレットを凍結保存培地（80% FBS、10% ジメチルスルホキシドおよび 10% MEM 培地）に最終濃度 500 万細胞/ml で再懸濁し、凍結バイアルに等分しました。 バイアルを -80 °C で一晩保管し、その後、長期保管のために液体窒素容器に移しました。

MSC注射と研究計画:

患者は、20日ごとに100×106個の細胞を2ヶ月以内に4回注射され、7回のスクリーニングを受けました。 MSCを300mlの生理食塩水とともに最大速度2×106細胞/分で患者に静脈内注射した。 各注入が完了するまでに約 30 分かかりました。 各注射後、患者は回復時間として少なくとも 6 時間病院に滞在しました。 これらの患者におけるMSC治療の有効性は、以下のパラメータを使用して評価された：肺機能検査（PFT）[1秒努力呼気量（FEV1）、努力肺活量（FVC）、FEV1/FVC]、体積脈波検査による総肺活量、単一呼吸の一酸化炭素拡散能力 (CO 拡散)、運動パフォーマンス [6 分間歩行テスト (6MWT)]、ボーグスケール呼吸困難評価 (BSDA)、COPD 評価テスト (CAT)、セント ジョージ呼吸器アンケート (SRGQ) および包括的安全性評価。