Mesenkymaalisten kantasolujen hoito sinappipotilaiden hengitysteiden uudelleenmuotoilun hoitoon

Potilaiden valinta:

Tässä kliinisessä tutkimuksessa tutkijat arvioivat MSC:iden terapeuttista vaikutusta SM:lle altistuneilla miespotilailla. Potilailla oli dokumentoitu kohtaaminen SM:n kanssa Iranin ja Irakin sodan aikana. Potilaat allekirjoittivat tietoisen suostumuksen ennen tutkimusta. Ne valittiin seuraavien kriteerien mukaan: (a) keuhkovaurion vakavuus vaihteli kohtalaisesta 50< pakotetun uloshengityksen tilavuudesta 1 sekunnissa (FEV1) <65 vakavaan 40<FEV1<50; (b) vasta-aiheiden puuttuminen spirometria (veriveritulppa, aivovaltimoiden tai aortan aneurysma, keuhkoembolia, hallitsematon verenpaine, äskettäinen ilmarinta, epäilemättä leikkaus/rintakehän äskettäinen, äskettäinen aivohalvaus); ja (c) ei koagulaatiota. Valintaprosessin poissulkemiskriteerit olivat seuraavat: (a) osallistua toiseen tutkimukseen samanaikaisesti; b) tupakointiympäristö; c) keuhkokuumeen olemassaolo tutkimuksen aikana; (d) verensiirtoreaktion ilmaantuvuus; e) muut taustalla olevat sairaudet (sydän- ja verisuonisairaudet, verenpainetauti, diabetes).

Rasvaperäisten kantasolujen eristäminen ja viljely:

200 ml vatsan rasvakudosta saatiin paikallispuudutuksessa rasvaimuaspiraattiprotokollalla. Lipoaspiraatti pestiin PBS:llä kudosjätteen poistamiseksi. 100 ml PBS, joka sisälsi 0,1 % w/v kollagenaasi A tyyppi I, lisättiin eristettyyn kudokseen ja inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 60 minuuttia. Kollagenaasiaktiivisuus neutraloitiin käyttämällä MEM-elatusainetta yhdessä 10 %:n naudan sikiön seerumin kanssa. Solupelletit suspendoitiin uudelleen viljelyalustaan ​​sentrifugoinnin jälkeen 2000 rpm 10 minuutin ajan ja siirrettiin sitten viljelypulloihin 72 tunniksi 37 °C:ssa 5 % CO2-olosuhteissa. Viljelyväliaine pulloissa vaihdettiin joka 3. päivä ja soluja siirrostettiin kaksi kertaa.

Virtaussytometrinen analyysi:

Solun pinta-antigeenin ilmentymisen analysoimiseksi 5 x 105 tuoretta solua kolmannesta siirrostuksesta kerättiin trypsiini-EDTA:lla. Solut sentrifugoitiin 100 g:ssä 1 minuutin ajan, suspendoitiin uudelleen värjäyspuskuriin (PBS, 2 % FBS) ja inkuboitiin sitten jäissä 10 minuuttia. Trypsiini neutraloitiin sentrifugilla ja eristetyt solut pestiin kahdesti PBS:llä ja lopuksi suspendoitiin uudelleen värjäyspuskuriin. Soluja inkuboitiin pimeässä ympäristössä 30 minuuttia. Inkuboinnin jälkeen solut leimattiin anti-ihmisen monoklonaalisilla vasta-aineilla (MAb), jotka oli konjugoitu fluorokromeihin. Nämä vasta-aineet olivat seuraavat: anti-CD90-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC), CD73-fykoerytriini (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Kaikkien immunoleimattujen solujen taajuudet analysoitiin FACS Canto II -virtaussytometrillä, jossa arvioitiin noin 500 000 tapahtumaa ja tiedot analysoitiin FlowJo-ohjelmistolla (versio 10.0).

Karyotyyppianalyysi poikkeavuuksien havaitsemiseksi:

Suoritettiin standardi Giemsa-värjäysmenettely ja kromosomivalmisteet saatiin 80 % konfluenteista soluista. Mikrotubulusten muodostumisen pysäyttämiseksi soluja käsiteltiin Colcemid-liuoksella. Mitoottisesti pysäytetyt solut kerättiin sitten käyttämällä trypsiini-EDTA:ta. Solut uutettiin ja upotettiin sitten 75 mmol/l KCl:aan 30 minuutiksi laboratoriolämpötilassa. Lopuksi ne saatiin sentrifugoimalla. Supernatantti korvattiin kiinnitysliuoksella ja suspensio levitettiin objektilaseille mikroskooppista tutkimusta ja kuvantamista varten. Ainakin 15 metafaasin leviämistä analysoitiin. Karyotyypit tarkasteltiin valomikroskoopilla käyttämällä sytovision ohjelmistoa.

Rasvaperäisten kantasolujen pakastaminen ja varastointi:

ADMSC:t kerättiin 90 %:n yhtymäkohdassa ennen injektiota jäädyttämistä varten. Solujen keräämiseksi elatusaine poistettiin ja korvattiin steriilillä PBS:llä ja kolmen minuutin kuluttua se korvattiin trypsiini-EDTA-liuoksella ja inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 5 minuuttia. Täydellinen väliaine (MEM, jossa oli 10 % FBS) lisättiin trypsiinin inaktivoimiseksi ja sentrifugoitiin 1500 rpm:llä 5 minuuttia. Solupelletti suspendoitiin uudelleen kylmäsäilytyselatusaineeseen (80 % FBS, 10 % dimetyylisulfoksidi ja 10 % MEM-elatusaine) lopullisella konsentraatiolla 5 miljoonaa solua millilitraa kohti ja jaettiin alikvooteihin kryovialeihin. Pullot säilytettiin -80 °C:ssa yön yli ja siirrettiin sitten nestetyppisäiliöön pitkäaikaista säilytystä varten.

MSC:n injektio ja tutkimussuunnitelma:

Potilaat saivat 100 x 106 solua joka 20. päivä neljään injektioon 2 kuukauden sisällä ja seulottiin 7 kertaa. MSC:t injektoitiin suonensisäisesti 300 ml:n normaalin suolaliuoksen kanssa potilaaseen maksiminopeudella 2 x 106 solua/min. Kunkin infuusion valmistuminen kesti noin 30 minuuttia. Jokaisen injektion jälkeen potilas viipyi sairaalassa vähintään 6 tuntia toipumisaikana. MSC-hoidon tehoa näillä potilailla arvioitiin seuraavilla parametreilla: keuhkojen toimintatesti (PFT) [pakotettu uloshengitystilavuus 1 sekunnissa (FEV1), pakotettu vitaalikapasiteetti (FVC), FEV1/FVC], keuhkojen kokonaiskapasiteetti kehon pletysmografialla, yhden hengityksen hiilimonoksidin diffuusiokapasiteetti (CO-diffuusio), harjoituskyky [6 minuutin kävelytesti (6MWT)], Borgin asteikon hengenahdistusarviointi (BSDA), COPD-arviointitesti (CAT), St. Georgen hengityskysely (SRGQ) ja kattava turvallisuusarviointi.