Terapia mezenchymalnymi komórkami macierzystymi w leczeniu przebudowy dróg oddechowych u pacjentów z musztardą

Wybór pacjentów:

W tym badaniu klinicznym badacze rozważali terapeutyczny efekt MSC u pacjentów płci męskiej narażonych na SM. Pacjenci mieli udokumentowane spotkanie z SM podczas wojny iracko-irańskiej. Pacjenci podpisywali świadomą zgodę przed badaniem. Zostali wybrani według następujących kryteriów: (a) ciężkość uszkodzenia płuc mieściła się w zakresie od umiarkowanego 50< natężonej objętości wydechowej w ciągu 1 sekundy (FEV1) <65 do ciężkiego 40<FEV1<50; (b) brak przeciwwskazań spirometrycznych (krwioplucie, tętniak tętnicy mózgowej lub aorty, zatorowość płucna, niekontrolowane ciśnienie tętnicze, przebyta odma opłucnowa, niewątpliwie przebyta operacja/klatka piersiowa, niedawny udar mózgu); oraz (c) brak koagulacji. Kryteria wykluczenia z procesu selekcji były następujące: (a) udział w innym badaniu w tym samym czasie; (b) siedlisko palenia; (c) występowanie zapalenia płuc podczas badania; (d) częstość występowania reakcji transfuzyjnych; (e) inne choroby współistniejące (choroba układu krążenia, nadciśnienie tętnicze, cukrzyca).

Izolacja i hodowla komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej:

200 ml brzusznej tkanki tłuszczowej uzyskano w znieczuleniu miejscowym za pomocą protokołu liposukcji aspiracyjnej. Lipoaspirat przemyto PBS w celu usunięcia resztek tkanki. Do wyizolowanej tkanki dodano 100 ml PBS zawierającego 0,1% wag./obj. kolagenazy typu I, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 60 minut. Aktywność kolagenazy neutralizowano przy użyciu pożywki MEM wraz z 10% płodową surowicą bydlęcą. Osady komórek ponownie zawieszono w pożywce hodowlanej po odwirowaniu przy 2000rpm przez 10 min, a następnie przeniesiono do kolb hodowlanych na 72 hw 37ºC w warunkach 5% CO2. Pożywkę hodowlaną w kolbach zmieniano co 3 dni, a komórki pasażowano dwukrotnie.

Analiza metodą cytometrii przepływowej:

Aby przeanalizować ekspresję antygenu powierzchniowego komórki, zebrano 5 x 105 świeżych komórek z trzeciego pasażu za pomocą trypsyny-EDTA. Komórki wirowano przy 100 g przez 1 minutę, ponownie zawieszono w buforze do barwienia (PBS, 2% FBS), a następnie inkubowano na lodzie przez 10 minut. Trypsynę zobojętniono przez wirowanie i wyizolowane komórki przemyto dwukrotnie PBS i na koniec ponownie zawieszono w buforze do barwienia. Komórki inkubowano w ciemnym otoczeniu przez 30 minut. Po inkubacji komórki znakowano anty-ludzkimi przeciwciałami monoklonalnymi (MAb) skoniugowanymi z fluorochromami. Były to następujące przeciwciała: anty-CD90-izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), CD73-fikoerytryna (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Częstotliwości wszystkich znakowanych immunologicznie komórek analizowano za pomocą cytometru przepływowego FACS Canto II, w którym oceniono około 500 000 zdarzeń i przeanalizowano dane przy użyciu oprogramowania FlowJo (wersja 10.0).

Analiza kariotypu w celu wykrycia nieprawidłowości:

Przeprowadzono standardową procedurę barwienia metodą Giemsy i otrzymano preparaty chromosomów z 80% konfluentnych komórek. Aby zatrzymać tworzenie mikrotubul, komórki traktowano roztworem Colcemid. Komórki zatrzymane w mitozie zebrano następnie przy użyciu trypsyny-EDTA. Komórki ekstrahowano, a następnie zanurzono w 75 mmol/l KCl na 30 minut w temperaturze laboratoryjnej. Ostatecznie uzyskano je przez wirowanie. Supernatant zastąpiono roztworem utrwalającym i zawiesinę rozprowadzono na szkiełkach do badania mikroskopowego i obrazowania. Przeanalizowano co najmniej 15 metafazowych spreadów. Kariotypy analizowano pod mikroskopem świetlnym przy użyciu oprogramowania do cytowizji.

Zamrażanie i przechowywanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej:

ADMSC zebrano przy 90% konfluencji przed wstrzyknięciem do zamrożenia. W celu zebrania komórek pożywkę hodowlaną usunięto i zastąpiono sterylnym PBS, a po trzech minutach zastąpiono ją roztworem trypsyna-EDTA, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 5 minut. Dodano kompletną pożywkę (MEM z 10% FBS) w celu inaktywacji trypsyny i wirowano przy 1500 obr./min przez 5 minut. Osad komórek ponownie zawieszono w pożywce do kriokonserwacji (80% FBS, 10% pożywki dimetylosulfotlenku i 10% pożywki MEM) z końcowym stężeniem 5 milionów komórek na mililitr i podzielono na porcje do kriofiolek. Fiolki przechowywano w temperaturze -80°C przez noc, a następnie przenoszono do pojemnika z ciekłym azotem w celu długoterminowego przechowywania.

Wstrzyknięcie MSCs i plan nauki:

Pacjenci otrzymywali 100 x 106 komórek co 20 dni przez cztery wstrzyknięcia w ciągu 2 miesięcy i byli badani 7 razy. MSC wstrzyknięto pacjentowi dożylnie wraz z 300 ml normalnej soli fizjologicznej z maksymalną szybkością 2 x 106 komórek/min. Każda infuzja trwała około 30 minut. Po każdym wstrzyknięciu pacjent pozostawał w szpitalu przez co najmniej 6 godzin jako czas rekonwalescencji. Skuteczność leczenia MSCs u tych pacjentów oceniano za pomocą następujących parametrów: test czynności płuc (PFT) [natężona objętość wydechowa w ciągu 1 sekundy (FEV1), natężona pojemność życiowa (FVC), FEV1/FVC], całkowita pojemność płuc metodą pletyzmografii ciała, zdolność dyfuzyjną tlenku węgla (dyfuzja CO) przy pojedynczym oddechu, wydolność wysiłkową [6-minutowy test marszu (6MWT)], ocenę duszności w skali Borga (BSDA), test oceny POChP (CAT), kwestionariusz oddechowy św. Jerzego (SRGQ) oraz kompleksowe ocena bezpieczeństwa.