머스타드 환자의 기도 리모델링 치료를 위한 중간엽 줄기세포 요법

환자 선택:

이 임상 시험에서 조사관은 SM에 노출된 남성 환자에서 MSC의 치료 효과를 고려했습니다. 환자는 이란-이라크 전쟁 중에 문서로 SM과 조우했습니다. 환자는 연구 전에 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다. 그들은 다음 기준에 따라 선택되었습니다. (b) 금기 사항 폐활량계의 부재(객혈, 뇌동맥류 또는 대동맥류, 폐색전증, 조절되지 않는 혈압, 최근의 기흉, 의심의 여지가 없는 수술/흉부 최근, 최근 뇌졸중); 및 (c) 응고 없음. 선택 과정에 대한 제외 기준은 다음과 같습니다: (a) 동시에 다른 연구에 참여; (b) 흡연 장소; (c) 연구 동안 폐렴의 존재; (d) 수혈 반응의 발생률; (e) 근본적인 다른 질병(심혈관 질환, 고혈압, 당뇨병).

지방 유래 줄기 세포의 분리 및 배양:

200mL의 복부 지방 조직을 지방 흡입 흡인 프로토콜에 의해 국소 마취 하에 얻었다. 지방흡입물을 PBS로 세척하여 조직 파편을 제거했습니다. 0.1% w/v 콜라게나제 A 유형 I을 포함하는 100mL PBS를 분리된 조직에 첨가한 다음 37ºC에서 60분 동안 배양했습니다. 콜라게나제 활성은 10% 태아 소 혈청과 함께 MEM 배지를 사용하여 중화되었습니다. 세포 펠렛은 2000rpm에서 10분 동안 원심분리한 후 배양 배지에 재현탁한 다음 배양 플라스크로 옮겨 37ºC, 5% CO2 조건에서 72시간 동안 배양했습니다. 플라스크의 배양액은 3일마다 교체하였고, 세포는 2회 계대하였다.

유세포 분석:

세포 표면 항원 발현을 분석하기 위해, 3차 계대의 5×10 5개의 신선한 세포를 트립신-EDTA로 수확하였다. 세포를 100g에서 1분 동안 원심분리하고 염색 완충액(PBS, 2% FBS)에 재현탁한 다음 얼음 위에서 10분 동안 배양했습니다. 트립신을 원심분리기로 중화시키고 분리된 세포를 PBS로 2회 세척하고 최종적으로 염색 완충액에 재현탁시켰다. 세포를 어두운 환경에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 형광색소에 접합된 항-인간 단클론 항체(MAbs)로 세포를 표지하였다. 이들 항체는 다음과 같다: 항-CD90-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), CD73-피코에리트린(PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. 모든 면역 표지된 세포의 빈도를 FACS Canto II 유세포 분석기로 분석했으며, 여기에서 약 500,000개의 이벤트를 평가하고 데이터를 FlowJo 소프트웨어(버전 10.0)를 사용하여 분석했습니다.

이상 검출을 위한 핵형 분석:

표준 Giemsa 염색 절차를 수행하고 80% 컨플루언트 세포로부터 염색체 제제를 얻었다. 미세소관 형성을 멈추기 위해, 세포를 Colcemid 용액으로 처리하였다. 이어서 유사분열 정지 세포를 트립신-EDTA를 사용하여 수확하였다. 세포를 추출한 다음 실험실 온도에서 30분 동안 75mmol/l KCl에 담갔다. 마지막으로 원심분리하여 얻었다. 상청액을 고정액으로 교체하고 현탁액을 현미경 검사 및 영상화를 위해 슬라이드에 펴 바릅니다. 적어도 15개의 중기 스프레드가 분석되었습니다. 핵형은 cytovision 소프트웨어를 사용하여 광학 현미경으로 고려되었습니다.

지방 유래 줄기 세포의 동결 및 보관:

ADMSC는 동결을 위해 주입하기 전에 90% 합류점에서 수확되었습니다. 세포를 수집하기 위해 배양 배지를 제거하고 멸균 PBS로 교체하고 3분 후 트립신-EDTA 용액으로 교체한 다음 37°C에서 5분 동안 배양하였다. 완전배지(MEM with 10% FBS)를 첨가하여 트립신을 불활성화시키고 1500rpm에서 5분간 원심분리하였다. 세포 펠릿을 밀리리터당 5백만 세포의 최종 농도로 동결보존 배지(80% FBS, 10% 디메틸설폭사이드 및 10% MEM 배지)에 재현탁하고 동결바이알에 분취하였다. 바이알은 밤새 -80°C에서 보관한 다음 장기 보관을 위해 액체 질소 용기로 옮겼습니다.

MSC 주입 및 연구 계획:

환자들은 2개월 동안 20일마다 100×106 세포를 4번 주사받았고 7번 스크리닝을 받았다. 중간엽 줄기세포는 300ml 생리 식염수와 함께 최대 속도 2×106개/분으로 환자에게 정맥 주사되었습니다. 각 주입을 완료하는 데 약 30분이 걸렸습니다. 각 주사 후 환자는 회복 시간으로 최소 6시간 동안 병원에 머물렀다. 이들 환자에서 중간엽 줄기세포 치료의 효능은 다음 매개변수를 사용하여 평가되었습니다: 폐기능 검사(PFT)[1초간 강제 호기량(FEV1), 강제 폐활량(FVC), FEV1/FVC], 신체 혈량 측정법에 의한 총 폐활량, 단일 호흡 일산화탄소 확산 능력(CO 확산), 운동 수행[6분 걷기 테스트(6MWT)], Borg 척도 호흡곤란 평가(BSDA), COPD 평가 테스트(CAT), St. George's Respiratory Questionnaire(SRGQ) 및 종합 안전성 평가.