Mesenkymala stamcellsterapi för behandling av luftvägsremodellering hos senappatienter

Patienturval:

I den här kliniska prövningen övervägde utredarna den terapeutiska effekten av MSC hos SM-exponerade manliga patienter. Patienter hade ett dokumenterat möte med SM under kriget mellan Iran och Irak. Patienterna undertecknade informerat samtycke före studien. De valdes ut enligt följande kriterier: (a) lungskadans svårighetsgrad varierade från måttlig 50< forcerad utandningsvolym på 1 sekund (FEV1) <65 till svår 40<FEV1<50; (b) avsaknad av kontraindikationer spirometri (hemoptys, cerebral arteriell aneurysm eller aorta, lungemboli, okontrollerat blodtryck, nyligen genomförd pneumothorax, utan tvekan kirurgi/nylig thorax, nyligen genomförd stroke); och (c) ingen koagulering. Uteslutningskriterierna för urvalsprocessen var följande: (a) delta i en annan studie samtidigt; (b) Bostad för rökning. (c) förekomsten av lunginflammation under studien; (d) förekomsten av transfusionsreaktioner; (e) bakomliggande andra sjukdomar (hjärt- och kärlsjukdomar, högt blodtryck, diabetes).

Isolering och odling av fetthärledda stamceller:

200 ml bukfettvävnad erhölls under lokalbedövning genom fettsugningsprotokoll. Lipoapiratet tvättades med PBS för att avlägsna vävnadsrester. 100 ml PBS innehållande 0,1% vikt/volym kollagenas A typ I sattes till isolerad vävnad och inkuberades sedan vid 37°C under 60 minuter. Kollagenasaktivitet neutraliserades med användning av MEM-medium tillsammans med 10 % fetalt bovint serum. Cellpellets återsuspenderades i odlingsmedium efter centrifugering vid 2000 rpm under 10 minuter och överfördes sedan till odlingskolvar i 72 timmar vid 37ºC i 5% CO2-tillstånd. Odlingsmediet i kolvarna byttes var tredje dag och cellerna fick passera två gånger.

Flödescytometrianalys:

För att analysera cellytantigenexpressionen skördades 5x105 färska celler från tredje passagen med trypsin-EDTA. Celler centrifugerades vid 100 g under 1 min, återsuspenderades i färgningsbuffert (PBS, 2% FBS) och inkuberades sedan på is under 10 minuter. Trypsin neutraliserades genom centrifugering och isolerade celler tvättades två gånger med PBS och återsuspenderades slutligen i färgningsbuffert. Celler inkuberades i mörk miljö under 30 minuter. Efter inkubation märktes cellerna med anti-humana monoklonala antikroppar (MAbs) konjugerade till fluorokromer. Dessa antikroppar var följande: anti-CD90-fluoresceinisotiocyanat (FITC), CD73-fykoerytrin (PE), CDllb-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Frekvenserna för alla immunmärkta celler analyserades med FACS Canto II flödescytometer, där cirka 500 000 händelser utvärderades och data analyserades med FlowJo-mjukvara (version 10.0).

Karyotypanalys för upptäckt av abnormiteter:

Standard Giemsa-färgningsprocedur utfördes och kromosomberedningar erhölls från 80% sammanflytande celler. För att stoppa bildning av mikrotubuli behandlades cellerna med Colcemid-lösning. De mitotiska arresterade cellerna skördades sedan med användning av trypsin-EDTA. Cellerna extraherades och nedsänktes sedan i 75 mmol/1 KCl under 30 minuter vid laboratorietemperatur. Slutligen erhölls de genom en centrifugering. Supernatanten ersattes med fixeringslösning och suspensionen spreds över objektglas för mikroskopisk undersökning och avbildning. Åtminstone 15 metafasspridningar analyserades. Karyotyperna övervägdes med ljusmikroskop med användning av en cytovision-mjukvara.

Frysning och lagring av fetthärledda stamceller:

ADMSCs skördades vid 90% sammanflöde före injektion för frysning. För att samla upp celler avlägsnades odlingsmediet och ersattes med sterilt PBS och efter tre minuter ersattes det med trypsin-EDTA-lösning och inkuberades sedan vid 37°C under 5 minuter. Komplett medium (MEM med 10 % FBS) tillsattes för att inaktivera trypsinet och centrifugerades vid 1500 rpm under 5 minuter. Cellpellet återsuspenderades i kryokonserveringsmedium (80 % FBS, 10 % dimetylsulfoxid och 10 % MEM-medium) med en slutlig koncentration av 5 miljoner celler per milliliter och uppdelades i alikvoter i kryoflaskor. Flaskorna förvarades vid -80 °C över natten och överfördes sedan till en behållare för flytande kväve för långtidsförvaring.

MSC:s injektion och studieplan:

Patienterna fick 100×106 celler var 20:e dag för fyra injektioner inom 2 månader och screenades för 7 gånger. MSCs injicerades intravenöst tillsammans med 300 ml normal koksaltlösning till patienten med en maximal hastighet av 2×106 celler/min. Varje infusion tog cirka 30 minuter att slutföras. Efter varje injektion stannade patienten på sjukhuset i minst 6 timmar som återhämtningstid. Effekten av MSC-behandling hos dessa patienter utvärderades med hjälp av följande parametrar: lungfunktionstest (PFT) [forcerad utandningsvolym på 1 sekund (FEV1), forcerad vitalkapacitet (FVC), FEV1/FVC], total lungkapacitet genom kroppspletysmografi, kolmonoxiddiffunderande kapacitet i ett andetag (CO diffusion), träningsprestanda [6-minuters promenadtest (6MWT)], Borg-skala dyspnébedömning (BSDA), COPD Assessment Test (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) och omfattande säkerhetsutvärdering.