Mesenchymale stamceltherapie voor de behandeling van remodellering van de luchtwegen bij mosterdpatiënten

Patiënten selectie:

In deze klinische studie onderzochten de onderzoekers het therapeutisch effect van MSC's bij aan SM blootgestelde mannelijke patiënten. Patiënten hadden een gedocumenteerde ontmoeting met SM tijdens de oorlog tussen Iran en Irak. De patiënten ondertekenden geïnformeerde toestemming vóór de studie. Ze werden geselecteerd op basis van de volgende criteria: (a) de ernst van de longbeschadiging varieerde van matig 50< geforceerd expiratoir volume in 1 seconde (FEV1) <65 tot ernstig 40<FEV1<50; (b) afwezigheid van contra-indicaties spirometrie (bloedspuwing, cerebraal arterieel aneurysma of aorta, longembolie, ongecontroleerde bloeddruk, recente pneumothorax, ongetwijfeld recente operatie/borstkas, recente beroerte); en (c) geen coagulatie. De uitsluitingscriteria voor het selectieproces waren als volgt: (a) tegelijkertijd deelnemen aan een ander onderzoek; (b) rokende habitat; (c) het bestaan ​​van longontsteking tijdens het onderzoek; (d) de incidentie van transfusiereacties; (e) die ten grondslag liggen aan andere ziekten (hart- en vaatziekten, hypertensie, diabetes).

Isolatie en kweek van uit vetweefsel afgeleide stamcellen:

200 ml adipeus weefsel van de buik werd verkregen onder plaatselijke verdoving door middel van liposuctie-aspiratenprotocol. Het lipoaspiraat werd gewassen met PBS om weefselresten te verwijderen. 100 ml PBS met 0,1% w/v collagenase A type I werd toegevoegd aan geïsoleerd weefsel en vervolgens gedurende 60 minuten bij 37°C geïncubeerd. Collagenase-activiteit werd geneutraliseerd met behulp van MEM-medium samen met 10% foetaal runderserum. Celpellets werden opnieuw gesuspendeerd in kweekmedium na centrifugatie bij 2000 rpm gedurende 10 minuten, en vervolgens overgebracht naar kweekflessen gedurende 72 uur bij 37°C in 5% CO2-conditie. Het kweekmedium in de kolven werd om de 3 dagen ververst en de cellen werden tweemaal gepasseerd.

Flowcytometrie-analyse:

Om de antigeenexpressie op het celoppervlak te analyseren, werden 5 x 105 verse cellen uit de derde passage geoogst met trypsine-EDTA. Cellen werden 1 minuut gecentrifugeerd bij 100 g, opnieuw gesuspendeerd in kleurbuffer (PBS, 2% FBS) en vervolgens 10 minuten op ijs geïncubeerd. Trypsine werd geneutraliseerd door middel van een centrifuge en geïsoleerde cellen werden tweemaal gewassen met PBS en tenslotte opnieuw gesuspendeerd in kleurbuffer. Cellen werden gedurende 30 minuten in een donkere omgeving geïncubeerd. Na incubatie werden de cellen gelabeld met anti-menselijke monoklonale antilichamen (MAb's) geconjugeerd aan fluorochromen. Deze antilichamen waren als volgt: anti-CD90-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), CD73-fycoerythrine (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. De frequenties van alle immunogelabelde cellen werden geanalyseerd door FACS Canto II flowcytometer, waarin ongeveer 500.000 gebeurtenissen werden beoordeeld en gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo-software (versie 10.0).

Karyotype-analyse voor detectie van afwijkingen:

Standaard Giemsa-kleuringsprocedure werd uitgevoerd en chromosoompreparaten werden verkregen uit 80% confluente cellen. Om de vorming van microtubuli te stoppen, werden de cellen behandeld met Colcemid-oplossing. De mitotisch gearresteerde cellen werden vervolgens geoogst met behulp van trypsine-EDTA. De cellen werden geëxtraheerd en vervolgens gedurende 30 minuten bij laboratoriumtemperatuur ondergedompeld in 75 mmol/l KCl. Uiteindelijk werden ze verkregen door centrifugeren. Het supernatant werd vervangen door een fixeeroplossing en de suspensie werd uitgespreid over objectglaasjes voor microscopisch onderzoek en beeldvorming. Er werden ten minste 15 metafase-spreads geanalyseerd. De karyotypes werden bekeken met een lichtmicroscoop met behulp van cytovision-software.

Invriezen en opslag van van vetweefsel afgeleide stamcellen:

ADMSC's werden vóór injectie voor invriezen geoogst bij 90% confluentie. Om cellen te verzamelen, werd kweekmedium verwijderd en vervangen door steriel PBS en na drie minuten werd het vervangen door trypsine-EDTA-oplossing en vervolgens gedurende 5 minuten bij 37°C geïncubeerd. Compleet medium (MEM met 10% FBS) werd toegevoegd om de trypsine te inactiveren, en 5 minuten gecentrifugeerd bij 1500 rpm. Celpellet werd opnieuw gesuspendeerd in cryopreservatiemedium (80% FBS, 10% dimethylsulfoxide en 10% MEM-medium) met een eindconcentratie van 5 miljoen cellen per milliliter en verdeeld in cryovials. De flesjes werden een nacht bewaard bij -80 °C en vervolgens overgebracht naar een container met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

MSC's injectie en studieplan:

Patiënten kregen elke 20 dagen 100 × 106 cellen voor vier injecties binnen 2 maanden en werden 7 keer gescreend. MSC's werden intraveneus samen met 300 ml normale zoutoplossing bij de patiënt geïnjecteerd met een maximale snelheid van 2 x 106 cellen/min. Elke infusie nam ongeveer 30 minuten in beslag. Na elke injectie verbleef de patiënt ten minste 6 uur in het ziekenhuis als hersteltijd. De werkzaamheid van de behandeling met MSC's bij deze patiënten werd geëvalueerd aan de hand van de volgende parameters: longfunctietest (PFT's) [geforceerd expiratoir volume in 1 seconde (FEV1), geforceerde vitale capaciteit (FVC), FEV1/FVC], totale longcapaciteit door plethysmografie van het lichaam, single-breath diffusiecapaciteit van koolmonoxide (CO-diffusie), trainingsprestaties [6-minuten looptest (6MWT)], Borg-schaal dyspnoebeoordeling (BSDA), COPD-beoordelingstest (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) en uitgebreide veiligheidsevaluatie.