Mesenchymale Stammzelltherapie zur Behandlung der Atemwegsumgestaltung bei Senfpatienten

Patientenauswahl:

In dieser klinischen Studie untersuchten die Forscher die therapeutische Wirkung von MSCs bei SM-exponierten männlichen Patienten. Die Patienten hatten während des Iran-Irak-Krieges eine dokumentierte Begegnung mit SM. Die Patienten unterzeichneten vor der Studie eine Einverständniserklärung. Sie wurden nach den folgenden Kriterien ausgewählt: (a) Der Schweregrad der Lungenschädigung lag zwischen mäßig 50 < forciertem Exspirationsvolumen in 1 Sekunde (FEV1) <65 und schwer 40 < FEV1 <50; (b) Fehlen von Kontraindikationen für die Spirometrie (Hämoptyse, zerebrales Arterien- oder Aortenaneurysma, Lungenembolie, unkontrollierter Blutdruck, kürzlicher Pneumothorax, zweifellos kürzlich durchgeführte Operation/Thorax, kürzlicher Schlaganfall); und (c) keine Koagulation. Die Ausschlusskriterien für das Auswahlverfahren waren wie folgt: (a) gleichzeitig an einer anderen Studie teilnehmen; (b) Raucherhabitat; (c) das Vorliegen einer Lungenentzündung während der Studie; (d) das Auftreten von Transfusionsreaktionen; (e) andere zugrunde liegende Krankheiten (Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Bluthochdruck, Diabetes).

Isolierung und Kultur von Stammzellen aus Fettgewebe:

200 ml Bauchfettgewebe wurden unter örtlicher Betäubung durch das Protokoll der Fettabsaugung gewonnen. Das Lipoaspirat wurde mit PBS gewaschen, um Gewebereste zu entfernen. 100 ml PBS mit 0,1 % w/v Kollagenase A Typ I wurden isoliertem Gewebe zugesetzt und dann 60 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Kollagenaseaktivität wurde unter Verwendung von MEM-Medium zusammen mit 10 % fötalem Rinderserum neutralisiert. Zellpellets wurden nach 10-minütiger Zentrifugation bei 2000 U/min im Kulturmedium resuspendiert und dann 72 Stunden lang bei 37 °C unter 5 % CO2-Bedingungen in Kulturflaschen überführt. Das Kulturmedium in den Flaschen wurde alle 3 Tage gewechselt und die Zellen wurden zweimal passagiert.

Durchflusszytometrie-Analyse:

Zur Analyse der Zelloberflächenantigenexpression wurden 5×105 frische Zellen aus der dritten Passage mit Trypsin-EDTA geerntet. Die Zellen wurden 1 Minute lang bei 100 g zentrifugiert, in Färbepuffer (PBS, 2 % FBS) resuspendiert und dann 10 Minuten lang auf Eis inkubiert. Trypsin wurde durch Zentrifuge neutralisiert und isolierte Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und schließlich in Färbepuffer resuspendiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang in dunkler Umgebung inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit antihumanen monoklonalen Antikörpern (MAbs) markiert, die an Fluorochrome konjugiert waren. Diese Antikörper waren wie folgt: Anti-CD90-Fluoresceinisothiocyanat (FITC), CD73-Phycoerythrin (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Die Häufigkeiten aller immunmarkierten Zellen wurden mit dem FACS Canto II-Durchflusszytometer analysiert, in dem etwa 500.000 Ereignisse bewertet und die Daten mit der FlowJo-Software (Version 10.0) analysiert wurden.

Karyotypanalyse zur Erkennung von Anomalien:

Es wurde ein Standard-Giemsa-Färbeverfahren durchgeführt und Chromosomenpräparate wurden aus 80 % konfluenten Zellen erhalten. Um die Bildung von Mikrotubuli zu stoppen, wurden die Zellen mit Colcemid-Lösung behandelt. Die mitotisch arretierten Zellen wurden dann mit Trypsin-EDTA geerntet. Die Zellen wurden extrahiert und dann 30 Minuten lang bei Labortemperatur in 75 mmol/l KCl getaucht. Abschließend werden sie durch eine Zentrifugation gewonnen. Der Überstand wurde durch Fixierlösung ersetzt und die Suspension zur mikroskopischen Untersuchung und Bildgebung auf Objektträger verteilt. Es wurden mindestens 15 Metaphasenausbreitungen analysiert. Die Karyotypen wurden mit einem Lichtmikroskop unter Verwendung einer Cytovision-Software untersucht.

Einfrieren und Lagern von Stammzellen aus Fettgewebe:

ADMSCs wurden bei 90 % Konfluenz vor der Injektion zum Einfrieren geerntet. Um Zellen zu sammeln, wurde das Kulturmedium entfernt und durch steriles PBS ersetzt. Nach drei Minuten wurde es durch Trypsin-EDTA-Lösung ersetzt und dann 5 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Zur Inaktivierung des Trypsins wurde Vollmedium (MEM mit 10 % FBS) zugegeben und 5 Minuten lang bei 1500 U/min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in Kryokonservierungsmedium (80 % FBS, 10 % Dimethylsulfoxid und 10 % MEM-Medium) mit einer Endkonzentration von 5 Millionen Zellen pro Milliliter resuspendiert und in Kryofläschchen aliquotiert. Die Fläschchen wurden über Nacht bei -80 °C gelagert und dann zur Langzeitlagerung in einen Behälter mit flüssigem Stickstoff überführt.

MSCs-Injektion und Studienplan:

Die Patienten erhielten alle 20 Tage 100 x 106 Zellen für vier Injektionen innerhalb von zwei Monaten und wurden sieben Mal untersucht. MSCs wurden dem Patienten zusammen mit 300 ml normaler Kochsalzlösung mit einer maximalen Rate von 2 × 106 Zellen/Minute intravenös injiziert. Es dauerte etwa 30 Minuten, bis jeder Aufguss abgeschlossen war. Nach jeder Injektion blieb der Patient zur Erholungszeit mindestens 6 Stunden im Krankenhaus. Die Wirksamkeit der MSC-Behandlung bei diesen Patienten wurde anhand der folgenden Parameter bewertet: Lungenfunktionstest (PFTs) [forciertes Exspirationsvolumen in 1 Sekunde (FEV1), forcierte Vitalkapazität (FVC), FEV1/FVC], Gesamtlungenkapazität durch Körperplethysmographie, Kohlenmonoxid-Diffusionskapazität bei einem Atemzug (CO-Diffusion), Trainingsleistung [6-Minuten-Gehtest (6MWT)], Dyspnoe-Bewertung nach Borg-Skala (BSDA), COPD-Bewertungstest (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) und umfassend Sicherheitsbewertung.