Terapia con células madre mesenquimales para el tratamiento de la remodelación de las vías respiratorias en pacientes con mostaza

Selección de pacientes:

En este ensayo clínico, los investigadores consideraron el efecto terapéutico de las MSC en pacientes masculinos expuestos a SM. Los pacientes tuvieron un encuentro documentado con SM durante la guerra Irán-Iraq. Los pacientes firmaron el consentimiento informado antes del estudio. Fueron seleccionados de acuerdo con los siguientes criterios: (a) la gravedad de la lesión pulmonar varió desde un volumen espiratorio forzado moderado en 1 segundo (FEV1) <65 a un volumen espiratorio forzado moderado en 1 segundo (FEV1) <65 a un 40<FEV1<50 grave; (b) ausencia de contraindicaciones espirometría (hemoptisis, aneurisma arterial cerebral o aórtico, embolismo pulmonar, presión arterial no controlada, neumotórax reciente, sin duda cirugía/torácica reciente, ictus reciente); y (c) sin coagulación. Los criterios de exclusión para el proceso de selección fueron los siguientes: (a) participar en otro estudio al mismo tiempo; (b) hábitat para fumadores; (c) la existencia de neumonía durante el estudio; (d) la incidencia de la reacción a la transfusión; (e) otras enfermedades subyacentes (enfermedad cardiovascular, hipertensión, diabetes).

Aislamiento y cultivo de células madre derivadas de tejido adiposo:

Se obtuvieron 200mL de tejido adiposo abdominal bajo anestesia local mediante protocolo de aspirado de liposucción. El lipoaspirado se lavó con PBS para eliminar los restos de tejido. Se añadieron 100 ml de PBS que contenían colagenasa A tipo I al 0,1 % p/v al tejido aislado y luego se incubaron a 37 °C durante 60 minutos. La actividad de colagenasa se neutralizó usando medio MEM junto con suero bovino fetal al 10%. Los sedimentos celulares se resuspendieron en medio de cultivo después de la centrifugación a 2000 rpm durante 10 minutos y luego se transfirieron a frascos de cultivo durante 72 horas a 37 ºC en condiciones de CO2 al 5 %. El medio de cultivo en los matraces se cambió cada 3 días y las células se pasaron dos veces.

Análisis de citometría de flujo:

Para analizar la expresión del antígeno de la superficie celular, se recogieron 5x105 células frescas del tercer pase mediante tripsina-EDTA. Las células se centrifugaron a 100 g durante 1 min, se resuspendieron en tampón de tinción (PBS, FBS al 2%) y luego se incubaron en hielo durante 10 minutos. La tripsina se neutralizó mediante centrífuga y las células aisladas se lavaron dos veces con PBS y finalmente se resuspendieron en tampón de tinción. Las células se incubaron en ambiente oscuro durante 30 minutos. Después de la incubación, las células se marcaron con anticuerpos monoclonales (MAb) antihumanos conjugados con fluorocromos. Estos anticuerpos fueron los siguientes: anti-CD90-isotiocianato de fluoresceína (FITC), CD73-ficoeritrina (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Las frecuencias de todas las células inmunomarcadas se analizaron con el citómetro de flujo FACS Canto II, en el que se evaluaron aproximadamente 500 000 eventos y los datos se analizaron con el software FlowJo (versión 10.0).

Análisis de cariotipo para detección de anomalías:

Se realizó el procedimiento estándar de tinción de Giemsa y se obtuvieron preparaciones de cromosomas a partir de células confluentes al 80%. Para detener la formación de microtúbulos, las células se trataron con solución de Colcemid. A continuación, las células detenidas en mitosis se recogieron usando tripsina-EDTA. Las células se extrajeron y luego se sumergieron en 75 mmol/l de KCl durante 30 minutos a temperatura de laboratorio. Finalmente, se obtuvieron por centrifugación. El sobrenadante se reemplazó con una solución fijadora y la suspensión se extendió sobre portaobjetos para el examen microscópico y la formación de imágenes. Se analizaron al menos 15 extensiones de metafase. Los cariotipos se consideraron con microscopio de luz usando un software de citovisión.

Congelación y almacenamiento de células madre derivadas de tejido adiposo:

Las ADMSC se recogieron al 90 % de confluencia antes de la inyección para la congelación. Para recolectar las células, se retiró el medio de cultivo y se reemplazó con PBS estéril y después de tres minutos se reemplazó con solución de tripsina-EDTA y luego se incubó a 37°C durante 5 minutos. Se añadió medio completo (MEM con FBS al 10 %) para inactivar la tripsina y se centrifugó a 1500 rpm durante 5 minutos. El sedimento celular se resuspendió en medio de crioconservación (80 % FBS, 10 % de dimetilsulfóxido y 10 % de medio MEM) con una concentración final de 5 millones de células por mililitro y se dividió en alícuotas en crioviales. Los viales se almacenaron a -80 °C durante la noche y luego se transfirieron a un recipiente de nitrógeno líquido para el almacenamiento a largo plazo.

Inyección de MSCs y Plan de estudios:

Los pacientes recibieron 100 × 106 células cada 20 días para cuatro inyecciones en 2 meses y se examinaron 7 veces. Las MSC se inyectaron por vía intravenosa junto con 300 ml de solución salina normal al paciente a una velocidad máxima de 2 x 106 células/min. Cada infusión tardó aproximadamente 30 minutos en completarse. Después de cada inyección, el paciente permaneció en el hospital durante al menos 6 horas como tiempo de recuperación. La eficacia del tratamiento de las CMM en estos pacientes se evaluó utilizando los siguientes parámetros: prueba de funciones pulmonares (PFT) [volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV1), capacidad vital forzada (FVC), FEV1/FVC], capacidad pulmonar total por pletismografía corporal, capacidad de difusión de monóxido de carbono (difusión de CO) en una sola respiración, rendimiento en el ejercicio [prueba de caminata de 6 minutos (6MWT)], evaluación de disnea en la escala de Borg (BSDA), prueba de evaluación de la EPOC (CAT), cuestionario respiratorio de St. George (SRGQ) y evaluación de seguridad.