间充质干细胞治疗芥末气道重塑患者

患者选择：

在这项临床试验中，研究人员考虑了 MSCs 在暴露于 SM 的男性患者中的治疗效果。患者在伊朗-伊拉克战争期间有过 SM 的记录。 患者在研究前签署知情同意书。 根据以下标准选择他们：(a) 肺损伤的严重程度从中度 50<第一秒用力呼气量 (FEV1) <65 到重度 40<FEV1<50； (b) 无肺活量测定禁忌症（咯血、脑动脉瘤或主动脉瘤、肺栓塞、血压失控、近期气胸、无疑手术/胸部近期、近期中风）； (c) 没有凝结。 选择过程的排除标准如下： (a) 同时参加另一项研究； (b) 吸烟区； (c) 研究期间存在肺炎； (d) 输血反应的发生率； (e) 潜在的其他疾病（心血管疾病、高血压、糖尿病）。

脂肪来源干细胞的分离培养：

在局部麻醉下通过吸脂抽吸方案获得 200mL 腹部脂肪组织。 用 PBS 洗涤脂肪抽吸物以去除组织碎片。 将含有 0.1% w/v 胶原酶 A I 的 100mL PBS 添加到分离的组织中，然后在 37ºC 下孵育 60 分钟。 使用含 10% 胎牛血清的 MEM 培养基中和胶原酶活性。 以 2000rpm 离心 10 分钟后，将细胞沉淀重悬于培养基中，然后转移至培养瓶中，在 37ºC、5% CO2 条件下培养 72 小时。 每3天更换一次烧瓶中的培养基，细胞传代两次。

流式细胞术分析：

为了分析细胞表面抗原的表达，通过胰蛋白酶-EDTA 从第三代收集 5×105 个新鲜细胞。 将细胞以 100 g 离心 1 分钟，重悬于染色缓冲液（PBS、2% FBS）中，然后在冰上孵育 10 分钟。 胰蛋白酶通过离心机中和，分离的细胞用 PBS 洗涤两次，最后重悬于染色缓冲液中。 细胞在黑暗环境中孵育 30 分钟。 孵育后，用与荧光染料偶联的抗人单克隆抗体 (MAb) 标记细胞。 这些抗体如下：抗CD90-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD73-藻红蛋白(PE)、CD11b-FITC、CD34-FITC、CD44-FITC、CD45-PE、CD105-PE。 通过 FACS Canto II 流式细胞仪分析所有免疫标记细胞的频率，其中评估了大约 500,000 个事件，并使用 FlowJo 软件（10.0 版）分析了数据。

用于异常检测的核型分析：

进行标准吉姆萨染色程序，并从 80% 汇合的细胞中获得染色体制剂。 为了阻止微管形成，用秋水仙碱溶液处理细胞。 然后使用胰蛋白酶-EDTA 收获有丝分裂停滞的细胞。 提取细胞，然后在实验室温度下将其浸入 75 mmol/l KCl 中 30 分钟。 最后，他们通过离心获得。 将上清液替换为固定液并将悬浮液铺展在载玻片上用于显微镜检查和成像。 至少分析了 15 个中期扩散。 使用细胞视觉软件通过光学显微镜考虑核型。

脂肪来源干细胞的冷冻和储存：

在注射冷冻前，ADMSC 在 90% 汇合时收获。 为收集细胞，去除培养基并用无菌 PBS 代替，三分钟后用胰蛋白酶-EDTA 溶液代替，然后在 37°C 下孵育 5 分钟。 添加完全培养基（含 10% FBS 的 MEM）以灭活胰蛋白酶，并以 1500 rpm 离心 5 分钟。 将细胞沉淀重新悬浮在冷冻保存培养基（80% FBS、10% 二甲基亚砜和 10% MEM 培养基）中，最终浓度为每毫升 500 万个细胞，并等分到冷冻管中。 小瓶在-80 °C 下储存过夜，然后转移到液氮容器中进行长期储存。

MSCs注射和研究计划：

患者每20天接受100×106个细胞，2个月内注射4次，筛选7次。 MSCs 与 300 ml 生理盐水一起以 2×106 个细胞/分钟的最大速率静脉注射给患者。 每次输液大约需要 30 分钟才能完成。 每次注射后，患者至少留院6小时作为恢复时间。 使用以下参数评估 MSCs 治疗这些患者的疗效：肺功能测试 (PFT) [1 秒用力呼气容积 (FEV1)、用力肺活量 (FVC)、FEV1/FVC]、体体积描记法的肺总量、单次呼吸一氧化碳扩散能力（CO diffusion）、运动表现[6分钟步行试验（6MWT）]、Borg量表呼吸困难评估（BSDA）、COPD评估测试（CAT）、圣乔治呼吸问卷（SRGQ）及综合安全评价。