Terapie mezenchymálními kmenovými buňkami pro léčbu remodelace dýchacích cest u pacientů s hořčicí

Výběr pacientů:

V této klinické studii vyšetřovatelé zvažovali terapeutický účinek MSC u mužských pacientů vystavených SM. Pacienti měli zdokumentované setkání s SM během íránsko-irácké války. Pacienti před studií podepsali informovaný souhlas. Byli vybráni podle následujících kritérií: (a) závažnost poškození plic byla v rozmezí od středně těžkého 50< usilovného výdechového objemu za 1 sekundu (FEV1) <65 do těžkého 40<FEV1<50; (b) nepřítomnost kontraindikací spirometrie (hemoptýza, cerebrální arteriální aneuryzma nebo aorta, plicní embolie, nekontrolovaný krevní tlak, nedávný pneumotorax, nepochybně operace/nedávná hrudní cévní mozková příhoda); a (c) žádná koagulace. Kritéria vyloučení pro výběrové řízení byla následující: a) účastnit se současně jiné studie; b) kuřácké prostředí; c) výskyt zápalu plic během studie; d) výskyt transfuzních reakcí; e) základní jiná onemocnění (kardiovaskulární onemocnění, hypertenze, diabetes).

Izolace a kultivace kmenových buněk derivovaných z tukové tkáně:

200 ml abdominální tukové tkáně bylo získáno v lokální anestezii pomocí protokolu liposukce aspirátů. Lipoaspirát byl promyt PBS, aby se odstranily zbytky tkáně. K izolované tkáni bylo přidáno 100 ml PBS obsahujícího 0,1 % w/v kolagenázy A typu I a poté inkubováno při 37 °C po dobu 60 minut. Aktivita kolagenázy byla neutralizována pomocí média MEM spolu s 10% fetálním hovězím sérem. Buněčné pelety byly resuspendovány v kultivačním médiu po centrifugaci při 2000 ot./min po dobu 10 minut a poté přeneseny do kultivačních baněk na 72 hodin při 37 °C v podmínkách 5 % CO2. Kultivační médium v ​​baňkách bylo měněno každé 3 dny a buňky byly dvakrát pasážovány.

Analýza průtokovou cytometrií:

Pro analýzu exprese buněčného povrchového antigenu bylo 5x105 čerstvých buněk ze třetí pasáže sklizeno pomocí trypsin-EDTA. Buňky byly centrifugovány při 100 g po dobu 1 minuty, resuspendovány v barvicím pufru (PBS, 2% FBS) a poté inkubovány na ledu po dobu 10 minut. Trypsin byl neutralizován centrifugací a izolované buňky byly dvakrát promyty PBS a nakonec resuspendovány v barvicím pufru. Buňky byly inkubovány v tmavém prostředí po dobu 30 minut. Po inkubaci byly buňky značeny anti-lidskými monoklonálními protilátkami (MAbs) konjugovanými s fluorochromy. Tyto protilátky byly následující: anti-CD90-fluorescein isothiokyanát (FITC), CD73-fykoerythrin (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Frekvence všech imunoznačených buněk byly analyzovány průtokovým cytometrem FACS Canto II, ve kterém bylo hodnoceno přibližně 500 000 událostí a data byla analyzována pomocí softwaru FlowJo (verze 10.0).

Analýza karyotypu pro detekci abnormalit:

Byl proveden standardní postup Giemsa barvení a preparáty chromozomů byly získány z 80 % konfluentních buněk. Pro zastavení tvorby mikrotubulů byly buňky ošetřeny roztokem Colcemidu. Mitoticky zastavené buňky pak byly sklizeny pomocí trypsin-EDTA. Buňky byly extrahovány a poté ponořeny do 75 mmol/l KCl na 30 minut při laboratorní teplotě. Nakonec byly získány centrifugací. Supernatant byl nahrazen fixačním roztokem a suspenze byla rozetřena na sklíčka pro mikroskopické vyšetření a zobrazování. Bylo analyzováno nejméně 15 metafázových spreadů. Karyotypy byly zvažovány světelným mikroskopem s použitím softwaru pro cytovizi.

Zmrazování a skladování kmenových buněk získaných z tukové tkáně:

ADMSC byly sklizeny při 90% konfluenci před injekcí pro zmrazení. Pro sběr buněk bylo kultivační médium odstraněno a nahrazeno sterilním PBS a po třech minutách bylo nahrazeno roztokem trypsin-EDTA a poté inkubováno při 37 °C po dobu 5 minut. Bylo přidáno kompletní médium (MEM s 10% FBS) pro inaktivaci trypsinu a centrifugováno při 1500 ot./min. po dobu 5 minut. Buněčná peleta byla resuspendována v kryokonzervačním médiu (80 % FBS, 10 % dimethylsulfoxid a 10 % MEM médium) s konečnou koncentrací 5 milionů buněk na mililitr a rozdělena do alikvotů do kryozkumavek. Lahvičky byly skladovány při -80 °C přes noc a poté přeneseny do nádoby s tekutým dusíkem pro dlouhodobé skladování.

Injekce MSC a plán studie:

Pacienti dostávali 100 x 106 buněk každých 20 dní ve čtyřech injekcích během 2 měsíců a byli 7krát vyšetřeni. MSC byly injikovány intravenózně spolu s 300 ml normálního fyziologického roztoku pacientovi při maximální rychlosti 2 x 106 buněk/min. Dokončení každé infuze trvalo přibližně 30 minut. Po každé injekci zůstal pacient v nemocnici alespoň 6 hodin jako čas na zotavení. Účinnost léčby MSC u těchto pacientů byla hodnocena pomocí následujících parametrů: test plicních funkcí (PFT) [usilovaný výdechový objem za 1 sekundu (FEV1), Forced vitální kapacita (FVC), FEV1/FVC], celková kapacita plic pomocí tělesné pletysmografie, kapacita difuze oxidu uhelnatého jedním dechem (difuze CO), výkon při cvičení [6minutový test chůze (6MWT)], hodnocení dušnosti podle Borgovy stupnice (BSDA), test hodnocení CHOPN (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) a komplexní hodnocení bezpečnosti.