Терапия мезенхимальными стволовыми клетками для лечения ремоделирования дыхательных путей у пациентов с ипритом

Отбор пациентов:

В этом клиническом исследовании исследователи рассмотрели терапевтический эффект МСК у пациентов мужского пола, подвергшихся воздействию СМ. Пациенты имели документально подтвержденный контакт со СМ во время ирано-иракской войны. Пациенты подписали информированное согласие перед исследованием. Их отбирали по следующим критериям: (а) тяжесть поражения легких варьировала от умеренной 50< объема форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1) <65 до тяжелой 40<ОФВ1<50; (б) отсутствие противопоказаний к спирометрии (кровохарканье, аневризма церебральных артерий или аорты, тромбоэмболия легочной артерии, неконтролируемое артериальное давление, недавний пневмоторакс, недавнее хирургическое вмешательство/торакальный, недавно перенесенный инсульт); и (c) отсутствие коагуляции. Критерии исключения из процесса отбора были следующими: (а) одновременное участие в другом исследовании; (б) место курения; (c) наличие пневмонии во время исследования; (г) частота трансфузионных реакций; д) сопутствующие другие заболевания (сердечно-сосудистые заболевания, артериальная гипертензия, диабет).

Выделение и культивирование стволовых клеток, полученных из жировой ткани:

200 мл абдоминальной жировой ткани было получено под местной анестезией по протоколу липосакции аспиратов. Липоаспират промывали PBS для удаления остатков тканей. 100 мл PBS, содержащего 0,1% масс./об. коллагеназы А типа I, добавляли к изолированной ткани и затем инкубировали при 37ºC в течение 60 минут. Коллагеназную активность нейтрализовали, используя среду МЕМ вместе с 10% эмбриональной бычьей сывороткой. Осадки клеток ресуспендировали в культуральной среде после центрифугирования при 2000 об/мин в течение 10 мин, а затем переносили в культуральные флаконы на 72 ч при 37°С в условиях 5% СО2. Среду культивирования в колбах меняли каждые 3 дня, клетки пассировали два раза.

Анализ проточной цитометрии:

Для анализа экспрессии антигена клеточной поверхности 5×105 свежих клеток из третьего пассажа собирали с помощью трипсина-ЭДТА. Клетки центрифугировали при 100 g в течение 1 мин, ресуспендировали в буфере для окрашивания (PBS, 2% FBS) и затем инкубировали на льду в течение 10 мин. Трипсин нейтрализовали центрифугированием, выделенные клетки дважды промывали PBS и, наконец, ресуспендировали в буфере для окрашивания. Клетки инкубировали в темноте в течение 30 минут. После инкубации клетки метили моноклональными антителами (МАт) человека, конъюгированными с флуорохромами. Эти антитела были следующими: анти-CD90-флуоресцеинизотиоцианат (FITC), CD73-фикоэритрин (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Частоты всех иммуномеченых клеток анализировали с помощью проточного цитометра FACS Canto II, в котором оценивали приблизительно 500 000 событий, а данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (версия 10.0).

Анализ кариотипа для выявления аномалий:

Выполняли стандартную процедуру окрашивания по Гимзе и получали препараты хромосом из 80% конфлюэнтных клеток. Для прекращения образования микротрубочек клетки обрабатывали раствором колцемида. Митотически задержанные клетки затем собирали с использованием трипсин-ЭДТА. Клетки экстрагировали и затем погружали в 75 ммоль/л KCl на 30 минут при лабораторной температуре. Наконец, их получают центрифугированием. Супернатант заменяли фиксирующим раствором, а суспензию распределяли по предметным стеклам для микроскопического исследования и визуализации. Было проанализировано не менее 15 метафазных спредов. Кариотипы рассматривали под световым микроскопом с использованием программного обеспечения «Цитовижн».

Замораживание и хранение стволовых клеток, полученных из жировой ткани:

ADMSC собирали при 90% слиянии перед инъекцией для замораживания. Для сбора клеток культуральную среду удаляли и заменяли стерильным PBS, а через три минуты ее заменяли раствором трипсин-ЭДТА и затем инкубировали при 37°C в течение 5 минут. Для инактивации трипсина добавляли полную среду (MEM с 10% FBS) и центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Осадок клеток ресуспендировали в криоконсервирующей среде (80% FBS, 10% диметилсульфоксид и 10% среда МЕМ) с конечной концентрацией 5 миллионов клеток на миллилитр и аликвотировали в криопробирки. Флаконы хранят при температуре -80°С в течение ночи, а затем переносят в контейнер с жидким азотом для длительного хранения.

Инъекция МСК и план исследования:

Пациенты получали 100×106 клеток каждые 20 дней в виде четырех инъекций в течение 2 месяцев и подвергались скринингу 7 раз. МСК вводили пациенту внутривенно вместе с 300 мл физиологического раствора с максимальной скоростью 2×106 клеток/мин. Каждая инфузия занимала приблизительно 30 минут. После каждой инъекции пациент оставался в больнице не менее 6 часов в качестве времени восстановления. Эффективность лечения МСК у этих больных оценивали по следующим параметрам: тест функции внешнего дыхания (ФВД) [объем форсированного выдоха за 1 секунду (ОФВ1), форсированная жизненная емкость легких (ФЖЕЛ), ОФВ1/ФЖЕЛ], общая емкость легких по данным бодиплетизмографии, диффузионная способность угарного газа при одном вдохе (диффузия CO), работоспособность при физической нагрузке [тест 6-минутной ходьбы (6MWT)], оценка одышки по шкале Борга (BSDA), оценочный тест ХОБЛ (CAT), респираторный опросник Святого Георгия (SRGQ) и всесторонний оценка безопасности.