Terapia con cellule staminali mesenchimali per il trattamento del rimodellamento delle vie aeree nei pazienti con senape

Selezione dei pazienti:

In questo studio clinico, i ricercatori hanno considerato l'effetto terapeutico delle MSC nei pazienti di sesso maschile esposti a SM. I pazienti hanno avuto un incontro documentato con SM durante la guerra Iran-Iraq. I pazienti hanno firmato il consenso informato prima dello studio. Sono stati selezionati in base ai seguenti criteri: (a) la gravità del danno polmonare variava da un volume espiratorio forzato moderato 50< in 1 secondo (FEV1) <65 a un grave 40<FEV1<50; (b) assenza di controindicazioni spirometriche (emottisi, aneurisma arterioso cerebrale o aortico, embolia polmonare, pressione arteriosa non controllata, pneumotorace recente, senza dubbio intervento chirurgico/toracico recente, ictus recente); e (c) assenza di coagulazione. I criteri di esclusione per il processo di selezione erano i seguenti: (a) partecipare a un altro studio contemporaneamente; (b) habitat per fumatori; (c) l'esistenza di polmonite durante lo studio; (d) l'incidenza della reazione trasfusionale; (e) sottostanti altre malattie (malattie cardiovascolari, ipertensione, diabete).

Isolamento e coltura di cellule staminali di derivazione adiposa:

200 ml di tessuto adiposo addominale sono stati ottenuti in anestesia locale mediante il protocollo di aspirati di liposuzione. Il lipoaspirato è stato lavato con PBS per rimuovere i detriti di tessuto. 100 ml di PBS contenente lo 0,1% p/v di collagenasi A di tipo I sono stati aggiunti al tessuto isolato e quindi incubati a 37°C per 60 minuti. L'attività della collagenasi è stata neutralizzata utilizzando il terreno MEM insieme al 10% di siero bovino fetale. I pellet cellulari sono stati risospesi nel terreno di coltura dopo la centrifugazione a 2000 giri/min per 10 minuti, quindi trasferiti in flaconi di coltura per 72 ore a 37°C in condizioni di CO2 al 5%. Il mezzo di coltura nelle fiasche è stato cambiato ogni 3 giorni e le cellule sono state fatte passare per due volte.

Analisi di citometria a flusso:

Per analizzare l'espressione dell'antigene sulla superficie cellulare, 5 × 105 cellule fresche dal terzo passaggio sono state raccolte mediante tripsina-EDTA. Le cellule sono state centrifugate a 100 g per 1 minuto, risospese in tampone colorante (PBS, 2% FBS) e quindi incubate in ghiaccio per 10 minuti. La tripsina è stata neutralizzata mediante centrifuga e le cellule isolate sono state lavate due volte con PBS e infine risospese in tampone colorante. Le cellule sono state incubate in un ambiente buio per 30 minuti. Dopo l'incubazione, le cellule sono state marcate con anticorpi monoclonali antiumani (MAbs) coniugati a fluorocromi. Questi anticorpi erano i seguenti: anti-CD90-fluoresceina isotiocianato (FITC), CD73-ficoeritrina (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Le frequenze di tutte le cellule immunomarcate sono state analizzate dal citometro a flusso FACS Canto II, in cui sono stati valutati circa 500.000 eventi e i dati sono stati analizzati utilizzando il software FlowJo (versione 10.0).

Analisi del cariotipo per il rilevamento delle anomalie:

È stata eseguita la procedura di colorazione Giemsa standard e le preparazioni cromosomiche sono state ottenute dall'80% di cellule confluenti. Per fermare la formazione di microtubuli, le cellule sono state trattate con una soluzione di Colcemid. Le cellule mitotiche arrestate sono state quindi raccolte utilizzando tripsina-EDTA. Le cellule sono state estratte e quindi immerse in 75 mmol/l KCl per 30 minuti a temperatura di laboratorio. Infine, hanno ottenuto da una centrifugazione. Il surnatante è stato sostituito con una soluzione fissativa e la sospensione è stata distribuita su vetrini per l'esame microscopico e l'imaging. Sono stati analizzati almeno 15 spread in metafase. I cariotipi sono stati considerati al microscopio ottico utilizzando un software cytovision.

Congelamento e conservazione delle cellule staminali di derivazione adiposa:

Gli ADMSC sono stati raccolti alla confluenza del 90% prima dell'iniezione per il congelamento. Per raccogliere le cellule, il mezzo di coltura è stato rimosso e sostituito con PBS sterile e dopo tre minuti è stato sostituito con una soluzione di tripsina-EDTA e quindi incubato a 37°C per 5 minuti. È stato aggiunto terreno completo (MEM con 10% FBS) per inattivare la tripsina e centrifugato a 1500 rpm per 5 minuti. Il pellet cellulare è stato risospeso in mezzo di crioconservazione (80% FBS, 10% dimetilsolfossido e 10% MEM) con una concentrazione finale di 5 milioni di cellule per millilitro e aliquotato in crioviali. Le fiale conservate a -80 °C durante la notte e poi trasferite in un contenitore di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

Iniezione di MSC e piano di studi:

I pazienti hanno ricevuto 100 × 106 cellule ogni 20 giorni per quattro iniezioni entro 2 mesi e sottoposti a screening per 7 volte. Le MSC sono state iniettate per via endovenosa insieme a 300 ml di soluzione fisiologica al paziente a una velocità massima di 2 × 106 cellule/min. Ciascuna infusione ha richiesto circa 30 minuti per essere completata. Dopo ogni iniezione, il paziente è rimasto in ospedale per almeno 6 ore come tempo di recupero. L'efficacia del trattamento con MSC in questi pazienti è stata valutata utilizzando i seguenti parametri: test di funzionalità polmonare (PFT) [volume espiratorio forzato in 1 secondo (FEV1), capacità vitale forzata (FVC), FEV1/FVC], capacità polmonare totale mediante pletismografia corporea, capacità di diffusione del monossido di carbonio in un singolo respiro (diffusione di CO), prestazione fisica [test del cammino di 6 minuti (6MWT)], valutazione della dispnea su scala Borg (BSDA), test di valutazione della BPCO (CAT), questionario respiratorio di St. George (SRGQ) e completo valutazione della sicurezza.