Thérapie par cellules souches mésenchymateuses pour le traitement du remodelage des voies respiratoires chez les patients moutarde

Sélection des patients :

Dans cet essai clinique, les chercheurs ont examiné l'effet thérapeutique des CSM chez les patients masculins exposés au SM. Les patients ont eu une rencontre documentée avec le SM pendant la guerre Iran-Irak. Les patients ont signé un consentement éclairé avant l'étude. Ils ont été sélectionnés selon les critères suivants : (a) la gravité de la lésion pulmonaire variait de modérée 50< volume expiratoire forcé en 1 seconde (FEV1) <65 à sévère 40<FEV1<50 ; (b) absence de contre-indications spirométrie (hémoptysie, anévrysme artériel cérébral ou aortique, embolie pulmonaire, tension artérielle non contrôlée, pneumothorax récent, sans doute chirurgie/thoracique récente, accident vasculaire cérébral récent) ; et (c) pas de coagulation. Les critères d'exclusion pour le processus de sélection étaient les suivants : (a) participer à une autre étude en même temps ; (b) habitat pour fumeurs; (c) l'existence d'une pneumonie au cours de l'étude ; (d) l'incidence des réactions transfusionnelles; (e) sous-jacentes à d'autres maladies (maladies cardiovasculaires, hypertension, diabète).

Isolement et culture de cellules souches d'origine adipeuse :

200 ml de tissu adipeux abdominal ont été obtenus sous anesthésie locale par le protocole d'aspirations de liposuccion. Le lipoaspirat a été lavé avec du PBS pour éliminer les débris tissulaires. 100 ml de PBS contenant 0,1 % p/v de collagénase A de type I ont été ajoutés au tissu isolé, puis incubés à 37 °C pendant 60 minutes. L'activité de la collagénase a été neutralisée en utilisant du milieu MEM avec 10 % de sérum bovin fœtal. Les culots cellulaires ont été remis en suspension dans un milieu de culture après centrifugation à 2 000 tr/min pendant 10 min, puis transférés dans des flacons de culture pendant 72 h à 37 ° C dans des conditions de 5 % de CO2. Le milieu de culture dans les flacons a été changé tous les 3 jours et les cellules ont été passées deux fois.

Analyse par cytométrie en flux :

Pour analyser l'expression de l'antigène de surface cellulaire, 5 x 105 cellules fraîches du troisième passage ont été récoltées par trypsine-EDTA. Les cellules ont été centrifugées à 100 g pendant 1 min, remises en suspension dans un tampon de coloration (PBS, 2 % FBS) puis incubées sur de la glace pendant 10 minutes. La trypsine a été neutralisée par centrifugation et les cellules isolées ont été lavées deux fois avec du PBS et finalement remises en suspension dans un tampon de coloration. Les cellules ont été incubées dans un environnement sombre pendant 30 minutes. Après incubation, les cellules ont été marquées avec des anticorps monoclonaux anti-humains (MAbs) conjugués à des fluorochromes. Ces anticorps étaient les suivants : anti-CD90-fluorescéine isothiocyanate (FITC), CD73-phycoérythrine (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Les fréquences de toutes les cellules immunomarquées ont été analysées par un cytomètre en flux FACS Canto II, dans lequel environ 500 000 événements ont été évalués et les données ont été analysées à l'aide du logiciel FlowJo (version 10.0).

Analyse du caryotype pour la détection des anomalies :

La procédure de coloration Giemsa standard a été réalisée et des préparations de chromosomes ont été obtenues à partir de cellules confluentes à 80 %. Pour arrêter la formation de microtubules, les cellules ont été traitées avec une solution de Colcemid. Les cellules arrêtées en mitose ont ensuite été récoltées en utilisant de la trypsine-EDTA. Les cellules ont été extraites puis immergées dans du KCl 75 mmol/l pendant 30 minutes à la température du laboratoire. Enfin, ils sont obtenus par une centrifugation. Le surnageant a été remplacé par une solution fixatrice et la suspension a été étalée sur des lames pour examen microscopique et imagerie. Au moins 15 étalements métaphasiques ont été analysés. Les caryotypes ont été examinés au microscope optique à l'aide d'un logiciel de cytovision.

Congélation et stockage des cellules souches dérivées de l'adipose :

Les ADMSC ont été récoltés à 90% de confluence avant injection pour congélation. Pour collecter les cellules, le milieu de culture a été retiré et remplacé par du PBS stérile et après trois minutes, il a été remplacé par une solution de trypsine-EDTA puis incubé à 37°C pendant 5 minutes. Du milieu complet (MEM avec 10 % de FBS) a été ajouté pour inactiver la trypsine et centrifugé à 1500 tr/min pendant 5 minutes. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans un milieu de cryoconservation (80 % de FBS, 10 % de diméthylsulfoxyde et 10 % de milieu MEM) avec une concentration finale de 5 millions de cellules par millilitre et aliquoté dans des cryotubes. Les flacons stockés à -80 ° C pendant la nuit, puis transférés dans un conteneur d'azote liquide pour un stockage à long terme.

Plan d'injection et d'étude des CSM :

Les patients ont reçu 100 × 106 cellules tous les 20 jours pour quatre injections en 2 mois et ont été dépistés 7 fois. Les CSM ont été injectées par voie intraveineuse avec 300 ml de solution saline normale au patient à une vitesse maximale de 2 x 106 cellules/min. Chaque perfusion a duré environ 30 minutes. Après chaque injection, le patient est resté à l'hôpital pendant au moins 6h comme temps de récupération. L'efficacité du traitement par CSM chez ces patients a été évaluée à l'aide des paramètres suivants : test des fonctions pulmonaires (PFT) [volume expiratoire maximal en 1 seconde (FEV1), capacité vitale forcée (FVC), FEV1/FVC], capacité pulmonaire totale par pléthysmographie corporelle, capacité de diffusion du monoxyde de carbone sur une seule respiration (diffusion de CO), performance physique [test de marche de 6 minutes (6MWT)], évaluation de la dyspnée sur l'échelle de Borg (BSDA), test d'évaluation de la MPOC (CAT), questionnaire respiratoire de St. George (SRGQ) et analyse complète évaluation de la sécurité.