Mesenkymale stamcelleterapi til behandling af luftvejsremodeling hos sennepspatienter

Patientvalg:

I dette kliniske forsøg overvejede efterforskerne den terapeutiske effekt af MSC'er hos SM-eksponerede mandlige patienter. Patienter havde et dokumenteret møde med SM under Iran-Irak-krigen. Patienterne underskrev informeret samtykke før undersøgelsen. De blev udvalgt i henhold til følgende kriterier: (a) sværhedsgraden af ​​lungeskaden varierede fra moderat 50< forceret ekspiratorisk volumen på 1 sekund (FEV1) <65 til alvorlig 40<FEV1<50; (b) fravær af kontraindikationer spirometri (hæmoptyse, cerebral arteriel aneurisme eller aorta, lungeemboli, ukontrolleret blodtryk, nylig pneumothorax, uden tvivl kirurgi/nylig thorax, nyligt slagtilfælde); og (c) ingen koagulering. Udelukkelseskriterierne for udvælgelsesprocessen var som følger: (a) deltage i en anden undersøgelse på samme tid; (b) rygehabitat; (c) eksistensen af ​​lungebetændelse under undersøgelsen; (d) forekomsten af ​​transfusionsreaktioner; (e) underliggende andre sygdomme (kardiovaskulær sygdom, hypertension, diabetes).

Isolering og dyrkning af fedtafledte stamceller:

200 ml abdominalt fedtvæv blev opnået under lokalbedøvelse ved fedtsugningsprotokol. Lipoaspiratet blev vasket med PBS for at fjerne vævsrester. 100 ml PBS indeholdende 0,1% w/v collagenase A type I blev tilsat til isoleret væv og derefter inkuberet ved 37°C i 60 minutter. Kollagenaseaktivitet blev neutraliseret under anvendelse af MEM-medium sammen med 10% føtalt bovint serum. Cellepelleter blev resuspenderet i dyrkningsmedium efter centrifugering ved 2000 rpm i 10 minutter og derefter overført til dyrkningskolber i 72 timer ved 37 ºC i 5 % CO2-betingelser. Dyrkningsmediet i kolberne blev skiftet hver 3. dag, og cellerne blev passeret to gange.

Flowcytometrianalyse:

For at analysere celleoverfladeantigenekspressionen blev 5 x 105 friske celler fra tredje passage høstet med trypsin-EDTA. Celler blev centrifugeret ved 100 g i 1 minut, resuspenderet i farvepuffer (PBS, 2% FBS) og derefter inkuberet på is i 10 minutter. Trypsin blev neutraliseret ved centrifugering, og isolerede celler blev vasket to gange med PBS og til sidst resuspenderet i farvepuffer. Celler blev inkuberet i mørke omgivelser i 30 minutter. Efter inkubation blev cellerne mærket med anti-humane monoklonale antistoffer (MAb'er) konjugeret til fluorochromer. Disse antistoffer var som følger: anti-CD90-fluorescein-isothiocyanat (FITC), CD73-phycoerythrin (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Frekvenserne af alle immunmærkede celler blev analyseret med FACS Canto II flowcytometer, hvor ca. 500.000 hændelser blev vurderet, og data blev analyseret ved hjælp af FlowJo-software (version 10.0).

Karyotypeanalyse til påvisning af abnormiteter:

Standard Giemsa-farvningsprocedure blev udført, og kromosompræparater blev opnået fra 80% konfluente celler. For at stoppe dannelsen af ​​mikrotubuli blev cellerne behandlet med Colcemid-opløsning. De mitotiske standsede celler blev derefter høstet under anvendelse af trypsin-EDTA. Cellerne blev ekstraheret og derefter nedsænket i 75 mmol/l KCl i 30 minutter ved laboratorietemperatur. Til sidst opnås de ved en centrifugering. Supernatanten blev erstattet med fiksativ opløsning, og suspensionen blev spredt over objektglas til mikroskopisk undersøgelse og billeddannelse. Mindst 15 metafasespredninger blev analyseret. Karyotyperne blev overvejet med lysmikroskop under anvendelse af en cytovision-software.

Frysning og opbevaring af fedtafledte stamceller:

ADMSC'er blev høstet ved 90% konfluens før injektion til frysning. For at opsamle celler blev dyrkningsmediet fjernet og erstattet med sterilt PBS, og efter tre minutter blev det erstattet med trypsin-EDTA-opløsning og derefter inkuberet ved 37°C i 5 minutter. Komplet medium (MEM med 10% FBS) blev tilsat for at inaktivere trypsinet og centrifugeret ved 1500 rpm i 5 minutter. Cellepelleten blev resuspenderet i kryokonserveringsmedium (80 % FBS, 10 % dimethylsulfoxid og 10 % MEM-medium) med en endelig koncentration på 5 millioner celler pr. milliliter og fordelt i kryoglas. Hætteglassene opbevares ved -80 °C natten over og overføres derefter til en beholder med flydende nitrogen til langtidsopbevaring.

MSCs injektion og studieplan:

Patienterne modtog 100×106 celler hver 20. dag til fire injektioner inden for 2 måneder og screenede 7 gange. MSC'er blev injiceret intravenøst ​​sammen med 300 ml normalt saltvand til patienten med en maksimal hastighed på 2×106 celler/min. Det tog ca. 30 minutter at fuldføre hver infusion. Efter hver injektion blev patienten på hospitalet i mindst 6 timer som restitutionstid. Effekten af ​​MSCs behandling hos disse patienter blev evalueret ved hjælp af følgende parametre: lungefunktionstest (PFT'er) [forceret ekspiratorisk volumen på 1 sekund (FEV1), forceret vitalkapacitet (FVC), FEV1/FVC], total lungekapacitet ved kropsplethysmografi, carbonmonoxiddiffunderende kapacitet med enkelt åndedræt (CO diffusion), træningspræstation [6-minutters gangtest (6MWT)], Borg-skala dyspnøvurdering (BSDA), COPD Assessment Test (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) og omfattende sikkerhedsvurdering.