Mesenchymális őssejtterápia mustárbetegek légúti remodellingjének kezelésére

Betegek kiválasztása:

Ebben a klinikai vizsgálatban a kutatók az MSC-k terápiás hatását vizsgálták SM-nek kitett férfi betegekben. A betegek dokumentáltan találkoztak SM-vel az iráni-iraki háború során. A betegek a vizsgálat előtt aláírták a beleegyezésüket. A következő kritériumok szerint választottuk ki őket: (a) a tüdősérülés súlyossága a mérsékelt 50< 1 másodperc alatti erőltetett kilégzési térfogattól (FEV1) <65 a súlyos 40<FEV1<50-ig terjedt; (b) ellenjavallatok hiánya spirometria (hemoptysis, agyi artériás aneurizma vagy aorta, tüdőembólia, kontrollálatlan vérnyomás, közelmúltban történt pneumothorax, kétségtelenül műtét/mellkasi közelmúltbeli, közelmúltbeli stroke); és (c) nincs koaguláció. A kiválasztási folyamat kizárási kritériumai a következők voltak: (a) egyidejűleg egy másik vizsgálatban való részvétel; b) dohányzóhely; c) tüdőgyulladás fennállása a vizsgálat során; (d) a transzfúziós reakció előfordulása; e) egyéb alapbetegségek (szív- és érrendszeri betegségek, magas vérnyomás, cukorbetegség).

Zsírból származó őssejtek izolálása és tenyésztése:

200 ml hasi zsírszövetet nyertünk helyi érzéstelenítésben zsírleszívás aspirátum protokollal. A lipoaspirátot PBS-sel mostuk a szövettörmelék eltávolítására. 100 ml PBS-t, amely 0,1 tömeg/térfogat% I típusú kollagenáz A-t tartalmazott, hozzáadtunk az izolált szövethez, majd 37 °C-on 60 percig inkubáltuk. A kollagenáz aktivitást MEM tápközeggel és 10% magzati szarvasmarha szérummal semlegesítettük. A sejtpelleteket 2000 ford./perc 10 perces centrifugálás után tenyésztőközegben reszuszpendáltuk, majd 72 órára 37°C-on 5%-os CO2-körülmények között tenyésztő lombikba vittük át. A lombikokban lévő tápközeget 3 naponta cseréltük, és a sejteket kétszer passzáltuk.

Áramlási citometriai elemzés:

A sejtfelszíni antigénexpresszió elemzéséhez 5×105 friss sejtet gyűjtöttünk be a harmadik passzázsból tripszin-EDTA-val. A sejteket 100 g-vel 1 percig centrifugáltuk, festőpufferben (PBS, 2% FBS) újraszuszpendáltuk, majd jégen 10 percig inkubáltuk. A tripszint centrifugálással semlegesítettük, és az izolált sejteket kétszer mostuk PBS-sel, végül festőpufferben újraszuszpendáltuk. A sejteket sötét környezetben 30 percig inkubáltuk. Inkubálás után a sejteket fluorokrómokhoz konjugált anti-humán monoklonális antitestekkel (MAbs) jelöltük. Ezek az antitestek a következők voltak: anti-CD90-fluoreszcein-izotiocianát (FITC), CD73-fikoeritrin (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Az összes immunjelölt sejt gyakoriságát FACS Canto II áramlási citométerrel elemezték, amelyben körülbelül 500 000 eseményt értékeltek, és az adatokat FlowJo szoftverrel (10.0 verzió) elemezték.

Kariotípus elemzés a rendellenességek kimutatására:

Standard Giemsa festési eljárást végeztünk, és a kromoszómapreparátumokat 80%-ban összefolyó sejtekből nyertük. A mikrotubulusok képződésének megállítása érdekében a sejteket Colcemid oldattal kezeltük. A mitotikus letartóztatott sejteket ezután tripszin-EDTA alkalmazásával összegyűjtöttük. A sejteket extraháltuk, majd laboratóriumi hőmérsékleten 30 percre 75 mmol/l KCl-be merítettük. Végül centrifugálással nyerték ki. A felülúszót fixáló oldattal helyettesítettük, és a szuszpenziót tárgylemezekre szórtuk mikroszkópos vizsgálat és képalkotás céljából. Legalább 15 metafázis-szórást elemeztek. A kariotípusokat fénymikroszkóppal vizsgáltuk citovíziós szoftver segítségével.

Zsírból származó őssejtek fagyasztása és tárolása:

Az ADMSC-ket 90%-os összefolyásnál gyűjtöttük be a fagyasztás céljából történő injekciózás előtt. A sejtek összegyűjtéséhez a táptalajt eltávolítottuk és steril PBS-sel helyettesítettük, majd három perc múlva tripszin-EDTA oldattal helyettesítettük, majd 37 °C-on 5 percig inkubáltuk. A tripszin inaktiválására komplett tápközeget (MEM 10% FBS-sel) adtunk, és 1500 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig. A sejtpelletet mélyhűtő tápközegben (80% FBS, 10% dimetil-szulfoxid és 10% MEM táptalaj) újraszuszpendáltuk 5 millió sejt/ml végkoncentrációval, és aliquot részeket osztottunk ki kriooviálokba. Az ampullákat egy éjszakán át -80 °C-on tárolták, majd folyékony nitrogén tartályba helyezték át hosszú távú tárolás céljából.

MSC injekció és vizsgálati terv:

A betegek 20 naponként 100 × 106 sejtet kaptak négy injekcióban 2 hónapon belül, és hét alkalommal szűrtek. Az MSC-ket intravénásan fecskendezték be 300 ml normál sóoldattal együtt a páciensbe, maximum 2×106 sejt/perc sebességgel. Mindegyik infúzió körülbelül 30 percet vett igénybe. Minden injekció után a beteg legalább 6 órán át a kórházban maradt, hogy felépüljön. Az MSC-kezelés hatékonyságát ezeknél a betegeknél a következő paraméterek segítségével értékelték: tüdőfunkciós teszt (PFT) [kényszerített kilégzési térfogat 1 másodperc alatt (FEV1), Forced vital kapacitás (FVC), FEV1/FVC], teljes tüdőkapacitás test pletizmográfiával, egyszeri lélegzetű szén-monoxid-diffundáló képesség (CO-diffúzió), edzésteljesítmény [6 perces séta teszt (6MWT)], Borg-skálájú nehézlégzés-értékelés (BSDA), COPD-felmérő teszt (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) és átfogó biztonsági értékelés.