Mesenkymale stamceller terapi for behandling av luftveisremodellering hos sennepspasienter

Pasientvalg:

I denne kliniske studien vurderte etterforskerne den terapeutiske effekten av MSC hos SM-eksponerte mannlige pasienter. Pasienter hadde et dokumentert møte med SM under Iran-Irak-krigen. Pasientene signerte informert samtykke før studien. De ble valgt i henhold til følgende kriterier: (a) alvorlighetsgraden av lungeskaden varierte fra moderat 50< tvungen ekspirasjonsvolum på 1 sekund (FEV1) <65 til alvorlig 40<FEV1<50; (b) fravær av kontraindikasjoner spirometri (hemoptyse, cerebral arteriell aneurisme eller aorta, lungeemboli, ukontrollert blodtrykk, nylig pneumothorax, uten tvil kirurgi/thorax nylig, nylig slag); og (c) ingen koagulering. Eksklusjonskriteriene for utvelgelsesprosessen var som følger: (a) delta i en annen studie på samme tid; (b) røykehabitat; (c) eksistensen av lungebetennelse under studien; (d) forekomsten av transfusjonsreaksjoner; (e) underliggende andre sykdommer (kardiovaskulær sykdom, hypertensjon, diabetes).

Isolering og kultur av fettavledede stamceller:

200 ml abdominalt fettvev ble oppnådd under lokalbedøvelse ved fettsugingsprotokoll. Lipoapiratet ble vasket med PBS for å fjerne vevsrester. 100mL PBS inneholdende 0,1% w/v kollagenase A type I ble tilsatt til isolert vev og deretter inkubert ved 37ºC i 60 minutter. Kollagenaseaktivitet ble nøytralisert ved bruk av MEM-medium sammen med 10 % føtalt bovint serum. Cellepelleter ble resuspendert i kulturmedium etter sentrifugering ved 2000 rpm i 10 minutter, og deretter overført til kulturkolber i 72 timer ved 37 ºC i 5 % CO2-tilstand. Kulturmediet i kolbene ble skiftet hver 3. dag, og cellene ble passert to ganger.

Flowcytometrianalyse:

For å analysere celleoverflateantigenekspresjonen ble 5×105 friske celler fra tredje passasje høstet med trypsin-EDTA. Celler ble sentrifugert ved 100 g i 1 min, resuspendert i fargebuffer (PBS, 2% FBS) og deretter inkubert på is i 10 minutter. Trypsin ble nøytralisert ved sentrifuge og isolerte celler ble vasket to ganger med PBS og til slutt resuspendert i fargebuffer. Celler ble inkubert i mørke omgivelser i 30 minutter. Etter inkubering ble cellene merket med anti-humane monoklonale antistoffer (MAbs) konjugert til fluorokromer. Disse antistoffene var som følger: anti-CD90-fluorescein-isotiocyanat (FITC), CD73-fykoerytrin (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. Frekvensene til alle immunmerkede celler ble analysert med FACS Canto II flowcytometer, hvor omtrent 500 000 hendelser ble vurdert og data ble analysert ved bruk av FlowJo-programvare (versjon 10.0).

Karyotypeanalyse for påvisning av abnormiteter:

Standard Giemsa-fargingsprosedyre ble utført og kromosompreparater ble oppnådd fra 80 % konfluente celler. For å stoppe dannelsen av mikrotubuli ble cellene behandlet med Colcemid-løsning. De mitotiske arresterte cellene ble deretter høstet ved bruk av trypsin-EDTA. Cellene ble ekstrahert og deretter nedsenket i 75 mmol/l KCl i 30 minutter ved laboratorietemperatur. Til slutt ble de oppnådd ved en sentrifugering. Supernatanten ble erstattet med fikseringsløsning og suspensjonen ble spredt over objektglass for mikroskopisk undersøkelse og avbildning. Minst 15 metafasespredninger ble analysert. Karyotypene ble vurdert med lysmikroskop ved bruk av en cytovision-programvare.

Frysing og lagring av fettavledede stamceller:

ADMSC-er ble høstet ved 90% konfluens før injeksjon for frysing. For å samle celler ble kulturmediet fjernet og erstattet med sterilt PBS og etter tre minutter ble det erstattet med trypsin-EDTA-løsning og deretter inkubert ved 37°C i 5 minutter. Komplett medium (MEM med 10 % FBS) ble tilsatt for å inaktivere trypsinet, og sentrifugert ved 1500 rpm i 5 minutter. Cellepelleten ble resuspendert i kryokonserveringsmedium (80 % FBS, 10 % dimetylsulfoksyd og 10 % MEM-medium) med en sluttkonsentrasjon på 5 millioner celler per milliliter og delt opp i kryovialer. Hetteglassene lagret ved -80 °C over natten og deretter overført til en flytende nitrogenbeholder for langtidslagring.

MSCs injeksjon og studieplan:

Pasientene fikk 100×106 celler hver 20. dag for fire injeksjoner innen 2 måneder og screenet for 7 ganger. MSC-er ble injisert intravenøst ​​sammen med 300 ml normal saltvann til pasienten med en maksimal hastighet på 2×106 celler/min. Det tok omtrent 30 minutter å fullføre hver infusjon. Etter hver injeksjon ble pasienten på sykehuset i minst 6 timer som restitusjonstid. Effekten av MSCs behandling hos disse pasientene ble evaluert ved å bruke følgende parametere: lungefunksjonstest (PFT) [forsert ekspirasjonsvolum på 1 sekund (FEV1), tvungen vitalkapasitet (FVC), FEV1/FVC], total lungekapasitet ved kroppspletysmografi, enkeltpust karbonmonoksiddiffusjonskapasitet (CO diffusjon), treningsytelse [6-minutters gangtest (6MWT)], Borg-skala dyspnévurdering (BSDA), COPD Assessment Test (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) og omfattende sikkerhetsvurdering.