Terapia com Células Tronco Mesenquimais para Tratamento de Remodelação de Vias Aéreas em Pacientes Mostarda

Seleção de pacientes:

Neste ensaio clínico, os investigadores consideraram o efeito terapêutico das MSCs em pacientes do sexo masculino expostos a SM. Os pacientes tiveram um encontro documentado com SM durante a guerra Irã-Iraque. Os pacientes assinaram consentimento informado antes do estudo. Eles foram selecionados de acordo com os seguintes critérios: (a) a gravidade da lesão pulmonar variou de moderado 50< volume expiratório forçado em 1 segundo (FEV1) <65 a grave 40<FEV1<50; (b) ausência de contraindicações espirométricas (hemoptise, aneurisma arterial cerebral ou aórtico, embolia pulmonar, pressão arterial descontrolada, pneumotórax recente, sem dúvida cirurgia/torácica recente, acidente vascular cerebral recente); e (c) sem coagulação. Os critérios de exclusão para o processo de seleção foram: (a) participar de outro estudo no mesmo período; (b) habitat para fumar; (c) a existência de pneumonia durante o estudo; (d) a incidência de reação transfusional; (e) outras doenças subjacentes (doenças cardiovasculares, hipertensão, diabetes).

Isolamento e cultura de células-tronco derivadas de tecido adiposo:

Foram obtidos 200mL de tecido adiposo abdominal sob anestesia local por protocolo de lipoaspiração de aspirados. O lipoaspirado foi lavado com PBS para remover restos de tecido. 100mL de PBS contendo 0,1% p/v de colagenase A tipo I foram adicionados ao tecido isolado e então incubados a 37ºC por 60 minutos. A atividade da colagenase foi neutralizada usando meio MEM juntamente com 10% de soro fetal bovino. Os pellets celulares foram ressuspensos em meio de cultura após centrifugação a 2000rpm por 10 min, e então transferidos para frascos de cultura por 72 h a 37ºC em 5% de CO2. O meio de cultura nos frascos foi trocado a cada 3 dias, e as células foram repassadas duas vezes.

Análise de citometria de fluxo:

Para analisar a expressão do antígeno de superfície celular, 5 × 105 células frescas da terceira passagem foram colhidas por tripsina-EDTA. As células foram centrifugadas a 100 g por 1 min, ressuspensas em tampão de coloração (PBS, 2% FBS) e depois incubadas em gelo por 10 minutos. A tripsina foi neutralizada por centrifugação e as células isoladas foram lavadas duas vezes com PBS e finalmente ressuspensas em tampão de coloração. As células foram incubadas em ambiente escuro por 30 minutos. Após a incubação, as células foram marcadas com anticorpos monoclonais anti-humanos (MAbs) conjugados com fluorocromos. Esses anticorpos foram os seguintes: isotiocianato de fluoresceína anti-CD90 (FITC), CD73-ficoeritrina (PE), CD11b-FITC, CD34-FITC, CD44-FITC, CD45-PE, CD105-PE. As frequências de todas as células imunomarcadas foram analisadas pelo citômetro de fluxo FACS Canto II, no qual aproximadamente 500.000 eventos foram avaliados e os dados foram analisados ​​usando o software FlowJo (versão 10.0).

Análise de cariótipo para detecção de anormalidades:

O procedimento padrão de coloração Giemsa foi realizado e as preparações cromossômicas foram obtidas a partir de 80% de células confluentes. Para interromper a formação de microtúbulos, as células foram tratadas com solução de Colcemid. As células paradas mitóticas foram então colhidas usando tripsina-EDTA. As células foram extraídas e então imersas em 75 mmol/l KCl por 30 minutos em temperatura de laboratório. Finalmente, eles obtidos por uma centrifugação. O sobrenadante foi substituído por solução fixadora e a suspensão foi espalhada sobre as lâminas para exame microscópico e imagem. Pelo menos, 15 spreads de metáfase foram analisados. Os cariótipos foram considerados com microscópio de luz usando um software cytovision.

Congelamento e armazenamento de células-tronco derivadas de tecido adiposo:

ADMSCs foram colhidas em 90% de confluência antes da injeção para congelamento. Para coletar as células, o meio de cultura foi removido e substituído por PBS estéril e após três minutos foi substituído por solução de tripsina-EDTA e então incubado a 37°C por 5 minutos. Meio completo (MEM com 10% FBS) foi adicionado para inativar a tripsina e centrifugado a 1500 rpm por 5 minutos. O sedimento celular foi ressuspenso em meio de criopreservação (80% FBS, 10% dimetilsulfóxido e 10% meio MEM) com uma concentração final de 5 milhões de células por mililitro e aliquotado em criotubos. Os frascos foram armazenados a -80 °C durante a noite e depois transferidos para um recipiente de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

Injeção de MSCs e plano de estudo:

Os pacientes receberam 100 × 106 células a cada 20 dias para quatro injeções em 2 meses e triados por 7 vezes. As MSCs foram injetadas por via intravenosa junto com 300 ml de solução salina normal no paciente a uma taxa máxima de 2 × 106 células/min. Cada infusão levou aproximadamente 30 minutos para ser concluída. Após cada injeção, o paciente permaneceu no hospital por pelo menos 6 horas como tempo de recuperação. A eficácia do tratamento com MSCs nesses pacientes foi avaliada usando os seguintes parâmetros: teste de função pulmonar (PFTs) [volume expiratório forçado em 1 segundo (FEV1), capacidade vital forçada (FVC), FEV1/FVC], capacidade pulmonar total por pletismografia corporal, capacidade de difusão de monóxido de carbono em respiração única (difusão de CO), desempenho em exercícios [teste de caminhada de 6 minutos (6MWT)], avaliação de dispneia na escala de Borg (BSDA), COPD Assessment Test (CAT), St. George's Respiratory Questionnaire (SRGQ) e abrangente avaliação de segurança.