先天性CMV感染後の胎児の脳発達に関する潜在的なバイオマーカーの開発

研究の理論的根拠 CMV による胎児感染後の周産期転帰を予測するための現在のツールは非常に限られています。 羊水穿刺は通常、胎児感染を診断するために妊娠 20 週から提供されます。 このサンプリングは、周産期の転帰を予測するための新しいアプローチを調査する機会を提供します。

この研究は、発達中の胎児に対するCMVの影響を研究するためのmRNAベースのアプローチを開発することを目的としています。 Hui 博士の博士論文は、発生に関する有意義な情報を提供する胎児の遺伝子発現「要約液」としての羊水 mRNA の研究に基づいていました。 この研究は、胎児の神経発達に関する情報が、無細胞胎児脳特異的転写産物 (mRNA) を介して羊水から得られることを示唆しています。

先天性 CMV のリスクがある女性が胎児感染の診断のために羊水穿刺を選択した場合、このサンプリングは RNA 分析のために AF のアリコートを収集する機会を提供します。 RNA シーケンス (RNAseq) は、特定の疾患状態で活発に発現する (「スイッチがオンになる」) 遺伝子の詳細な分析を可能にする比較的新しい技術です。 研究者は、羊水に RNA シーケンシング法を適用して、潜在的な遺伝子発現の違いを検索します。これは、機能分析を通じて疾患を理解し、将来の研究のための候補バイオマーカーを特定するのに役立つ可能性があります。

CMV に感染した胎児は、感染していない胎児と比較して遺伝子発現プロファイルが変化するという仮説は、羊水の無細胞 RNA で確認されています。

目的 RNA シーケンス技術を使用して、CMV に感染した胎児と感染していない胎児の AF RNA の比較全トランスクリプトーム解析を実行します。

方法 これは、メルボルン (Mercy Hospital for Women)、シドニー (Royal Hospital for Women、Randwick)、および Leuven (UZ Leuven、Leuven) の胎児医学ユニットを含む多施設研究です。 調査員は、2 年間で 20 人の女性 (10 人の症例、10 人の対照) を募集することを目指しています。

サンプルは、先天性感染症の有無を診断する目的で実施される臨床的に示される羊水穿刺中に収集されます。 これは通常、妊娠初期のセロコンバージョンのある女性の場合は妊娠 20 ～ 21 週で、または構造異常のある紹介の場合は胎児の評価時に行われます。 調査研究には 5 ～ 10ml の羊水 (AF) 量が必要です。 このサンプル量は、手順を実行する臨床医に重大な負担を課すことはなく (追加の収集時間はわずか 10 ～ 20 秒)、追加の針挿入がないため、妊娠中または女性の手順のリスクは増加しません (時間の増加はありません)。流産または胎児または母体の健康への影響）。

研究サンプルは、それぞれの募集サイトで臨床サンプルとは別のバイアルに保管されます。 摂氏 4 度で保存し、収集後 6 時間以内に 300 x g で 10 分間遠心分離します。 AF 上清を取り出し、別のチューブに保存します。 細胞部分と上清の両方を凍結し、-80°Cで保存します。 シドニーの募集サイトは、ドライアイスで検体を Mercy Hospital for Women のメルボルン大学研究所に輸送し、そこで処理されます。 すべてのサンプルには、参加者のプライバシーを保護するために、Mercy Hospital for Women のメルボルン大学研究所に輸送する前に、研究サンプル ID 番号が付与されます。

在胎週数と胎児の性別を一致させた 10 人の CMV 感染胎児と 10 人の未感染胎児の AF サンプルの全 RNA を分析します。 Qiagen Circulating Nucleic Acid抽出キットを使用して、AF上清サンプルから全RNAを抽出します。 全トランスクリプトーム増幅および無細胞 RNA の RNA シーケンシングが実行され、AF RNA の以前の研究で実行されたように、ペア分析で比較された症例群と対照群の発現プロファイルが比較されます。 異なる調節遺伝子の経路解析は、生物学的解釈に使用されます。 研究者は、広く使用されている商用ソフトウェア (Ingenuity Pathway Analysis™) と、タフツ大学 (DFLAT) の共同研究者によって開発された胎児固有の機能分析ツールの両方を採用します。

最もダウンレギュレートおよびアップレギュレートされた脳転写物は、将来の検証研究のための異常な結果の候補バイオマーカーとして特定されます。

母親と赤ちゃんの産後6週間までの妊娠転帰は、超音波またはMRIで検出された胎児の異常、妊娠と出生方法、出生時体重、出生前療法の使用（CMV免疫グロブリンまたはその他）、新生児調査など、病院の医療記録から収集されます。尿/唾液/臍帯血検査の結果、頭蓋超音波検査、身体検査、新生児聴覚スクリーニングの結果など。

期待される結果: 感染していない胎児と比較して、CMV に感染した胎児は機能解析で神経発達経路と遺伝子発現の変化を示します。 CMV 感染胎児で示差的に発現する胎児脳特異的転写産物は、将来の検証研究のための神経発達転帰の候補バイオマーカーとして特定されます。

データの保存とセキュリティ データベースは、研究のための患者データのキャプチャをサポートするように設計された、無料で安全な Web ベースのアプリケーションである RedCap (Research Electronic Data Capture) 内にセットアップされます。 メルボルン大学の REDCap サービスは、大学の基準と米国の健康情報およびプライバシー法に準拠した安全なストレージとバックアップ ポリシーを提供します。 このデータベースにアクセスできるのは研究者だけです。

同意書およびその他の研究情報のハード コピーは、施錠されたファイリング キャビネットに保管されます。 調査担当者と HREC のみがファイルにアクセスできます。

6.0 包含基準 Mercy Hospital for Women または Royal Hospital for Women、Randwick の周産期医療部門を通じて、先天性 CMV 感染が疑われるために臨床的に示唆された羊水穿刺を受けている女性は、Dr Hui または Dr Shand による周産期クリニックの紹介からそれぞれ識別されます。 これらの女性には、(i) 妊娠中の母体の一次 CMV 感染の証拠がある女性 (ii) 先天性 CMV 感染を示唆する構造異常を有する胎児 (Hui L および Wood G に記載されているように)。実用的な最新情報とカウンセリング支援。 2015 出生前診断; 35:1-7。 ) インフォームド・コンセントを与えることができる18歳以上の英語を話す女性が対象となります.

胎児CMV感染が確認された被験者は、ケースグループを形成します。 先天性感染の証拠のない胎児は、対照群を形成します。 CMV 陰性の構造異常胎児は、対照群分析から除外されます。 母体感染後の感染した胎児と感染していない胎児の割合は約 40% であるため、目標とするサンプル サイズに対して、症例と対照の妥当な比率が予想されます。

最初の連絡は臨床チームによって行われますが、研究助産師によるフォローアップは、可能な限り臨床相談の後、電話または対面で行われます。 これは、臨床医が研究について患者の同意を得ることによる潜在的な対立を最小限に抑えるためです。 患者は、参加する義務を負わないこと、およびその決定が臨床ケアまたは治療する医師との関係に影響を与えないことを安心させます周産期医学のそれぞれの部門のキャビネット。

除外基準 同意のない女性、医療行為に同意できない女性、英語が話せない女性、18歳未満の女性。

統計分析 サンプル サイズ 一般に、生物学的複製が多いほど (サンプル サイズが大きいほど)、遺伝子発現データから得られる推論はより強力になります。 サンプル間の生物学的変動と遺伝子発現差の予想される広がりは、理想的なサンプルサイズに影響を与える重要な要因です。 この研究では、研究者は遺伝子発現レベルがどのように分布するかを事前に知らないため、RNA-seq実験にサンプルサイズアルゴリズムを使用する能力が制限されています. 上記で説明したサンプルの入手可能性に関する制限に加えて、実験室での処理に伴う高コストにより、多数の AF サンプルを使用する可能性が制限されていました。

RNA シーケンシング実験の正式なサンプル サイズの計算に影響を与える主な要因は、シーケンシングの深さ、変動係数、検出された発現差の大きさ、偽陽性率と検出力です。 平均読み取り深度が 20、グループ内の変動係数が 0.4、効果サイズが 2 倍、偽陽性率が 0.05、検出力が 80% であると仮定すると、必要なグループあたりの被験者数は 7.1 です。グループごとに 10 個のサンプル。

差次的遺伝子発現の解析と機能解析 Translational Obstetric Group 内のコンサルタント バイオインフォマティクス スペシャリストが、遺伝子発現データの統計および解析サポートを利用できます。 非感染対照と比較してCMV感染症例で有意に調節不全である遺伝子が同定される。 差次的に発現する遺伝子の機能分析は、Ingenuity Pathways Analysis (IPA) バージョン 9.0 ソフトウェア (Ingenuity; Redwood City, CA) を使用して実行されます。 Ingenuity は、特定のデータ セットで過剰に表現された生物学的プロセスを特定し、フィッシャーの右側検定を使用して各結果の有意性スコアを計算する手動で精選されたデータベースです。 研究者はまた、周産期データセット (http://dflat.cs.tufts.edu) の生物学的解釈を強化することが以前に示されている、公的に入手可能な胎児固有の機能注釈「タフツでの発達機能注釈」(DFLAT) も使用します。