Ontwikkeling van potentiële biomarkers voor foetale hersenontwikkeling na congenitale CMV-infectie

Rationale voor de studie De huidige instrumenten voor het voorspellen van de perinatale uitkomst na foetale infectie met CMV zijn zeer beperkt. Vruchtwaterpunctie wordt meestal aangeboden vanaf 20 weken zwangerschap om foetale infectie te diagnosticeren. Deze bemonstering biedt de mogelijkheid om nieuwe benaderingen voor het voorspellen van perinatale uitkomst te onderzoeken.

Deze studie heeft tot doel een op mRNA gebaseerde benadering te ontwikkelen om de impact van CMV op de zich ontwikkelende foetus te bestuderen. Dr. Hui's proefschrift was gebaseerd op de studie van amnionvloeistof-mRNA als genexpressie "summiere vloeistof" van de foetus die zinvolle informatie geeft over ontwikkeling. Dit werk suggereerde dat informatie over foetale neurologische ontwikkeling kan worden verkregen uit vruchtwater via celvrije foetale hersenspecifieke transcripten (mRNA's).

Als een vrouw met risico op congenitale CMV ervoor kiest om een ​​vruchtwaterpunctie te ondergaan voor de diagnose van foetale infectie, biedt deze bemonstering de mogelijkheid om een ​​hoeveelheid AF te verzamelen voor RNA-analyse. RNA-sequencing (RNAseq) is een relatief nieuwe technologie die gedetailleerde analyse mogelijk maakt van de genen die actief tot expressie komen ('ingeschakeld') tijdens een bepaalde ziektetoestand. De onderzoekers zullen RNAsequencing-methoden toepassen op vruchtwater om te zoeken naar mogelijke genexpressieverschillen die kunnen helpen bij het begrijpen van de ziekte door middel van functionele analyse en het identificeren van kandidaat-biomarkers voor toekomstige studies.

Hypothese dat met CMV geïnfecteerde foetussen een veranderd genexpressieprofiel zullen hebben in vergelijking met niet-geïnfecteerde foetussen, zoals vastgesteld in celvrij RNA uit vruchtwater.

Doelstellingen Het uitvoeren van een vergelijkende volledige transcriptoomanalyse van AF-RNA van CMV-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde foetussen met behulp van RNA-sequencingtechnologie.

Methoden Dit wordt een multicentrische studie met afdelingen voor foetale geneeskunde in Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) en Leuven (UZ Leuven, Leuven). De onderzoekers streven ernaar om gedurende 2 jaar 20 vrouwen (10 gevallen, 10 controles) te rekruteren.

Monsters zullen worden verzameld tijdens klinisch geïndiceerde vruchtwaterpunctie die wordt uitgevoerd om de aan- of afwezigheid van een aangeboren infectie te diagnosticeren. Dit wordt meestal uitgevoerd bij een zwangerschapsduur van 20-21 weken voor vrouwen met seroconversie in het begin van de zwangerschap, of op het moment van beoordeling van de foetus in geval van verwijzingen met structurele afwijkingen. Voor de onderzoeksstudie zou een vruchtwatervolume (AF) van 5-10 ml nodig zijn. Dit monstervolume vormt geen significante belasting voor de clinicus die de procedure uitvoert (slechts 10-20 seconden extra verzameltijd) en verhoogt het risico van de procedure voor de zwangerschap of vrouw niet, aangezien er GEEN extra naaldinbrenging is (geen toename in miskraam of gevolgen voor het welzijn van de foetus of moeder).

Het onderzoeksmonster wordt op de respectieve wervingslocaties in een afzonderlijk flesje voor het klinische monster bewaard. Het wordt bewaard bij 4 graden Celsius en vervolgens gecentrifugeerd bij 300 x g gedurende 10 minuten binnen 6 uur na verzameling. Het AF-supernatant wordt verwijderd en in een apart buisje bewaard. Zowel het cellulaire gedeelte als het supernatant zullen worden ingevroren en bewaard bij -80°C. De rekruteringssite in Sydney zal de monsters op droogijs vervoeren naar het laboratorium van de Universiteit van Melbourne in het Mercy Hospital for Women, waar ze zullen worden verwerkt. Alle monsters krijgen een ID-nummer van het studiemonster voordat ze naar het onderzoekslaboratorium van de Universiteit van Melbourne in het Mercy Hospital for Women worden vervoerd om de privacy van de deelnemers te beschermen.

Totaal RNA van AF-monsters van 10 CMV-geïnfecteerde en 10 niet-geïnfecteerde foetussen, gekoppeld aan zwangerschapsduur en foetaal geslacht, zal worden geanalyseerd. Totaal RNA zal worden geëxtraheerd uit de AF-supernatantmonsters en zal worden uitgevoerd met behulp van de Qiagen Circulating Nucleic Acid-extractiekit. Gehele transcriptoomamplificatie en RNA-sequencing van het celvrije RNA zal worden uitgevoerd en de expressieprofielen van de casus- en controlegroepen zullen worden vergeleken in een gepaarde analyse zoals uitgevoerd in eerdere studies van AF RNA. Pathway-analyse van de differentieel gereguleerde genen zal gebruikt worden voor de biologische interpretatie. De onderzoekers zullen gebruik maken van zowel veelgebruikte commerciële software (Ingenuity Pathway Analysis™) als een foetusspecifieke functionele analysetool ontwikkeld door medewerkers van Tufts University (DFLAT).

De meest naar beneden en naar boven gereguleerde hersentranscripties zullen worden geïdentificeerd als kandidaat-biomarkers van abnormale uitkomst voor toekomstige validatiestudies.

Zwangerschapsuitkomsten tot zes weken na de bevalling voor moeder en baby worden verzameld uit het medisch dossier van het ziekenhuis, inclusief foetale afwijkingen gedetecteerd op echografie of MRI, zwangerschap en geboortewijze, geboortegewicht, gebruik van prenatale therapieën (CMV-immunoglobuline of andere), onderzoeken bij pasgeborenen zoals resultaten van urine-/speeksel-/navelstrengbloedonderzoek, craniale echografie, lichamelijk onderzoek en resultaten van gehoorscreening bij pasgeborenen.

Verwachte resultaten: Vergeleken met niet-geïnfecteerde foetussen, zullen CMV-geïnfecteerde foetussen veranderde neurologische ontwikkelingsroutes en genexpressie laten zien bij functionele analyse. Foetale-hersenspecifieke transcripten die differentieel tot expressie worden gebracht in CMV-geïnfecteerde foetussen zullen worden geïdentificeerd als kandidaat-biomarkers van neurologische ontwikkelingsresultaten voor toekomstige validatiestudies.

Gegevensopslag en beveiliging De database wordt opgezet binnen RedCap (Research Electronic Data Capture), een gratis, veilige, webgebaseerde toepassing die is ontworpen om het vastleggen van patiëntgegevens voor onderzoeksstudies te ondersteunen. De REDCap-service van de Universiteit van Melbourne biedt een veilig opslag- en back-upbeleid dat voldoet aan de normen van de Universiteit en de Amerikaanse Health Information and Privacy Act. Alleen de onderzoeksonderzoekers hebben toegang tot deze database.

Gedrukte exemplaren van toestemmingsformulieren en andere studie-informatie worden bewaard in afgesloten archiefkasten. Alleen de onderzoeksonderzoekers en de HREC hebben toegang tot de bestanden.

6.0 Inclusiecriteria Vrouwen die een klinisch geïndiceerde vruchtwaterpunctie ondergaan voor vermoedelijke congenitale CMV-infectie door de afdeling perinatale geneeskunde van het Mercy Hospital for Women of het Royal Hospital for Women, Randwick, zullen worden geïdentificeerd op basis van de perinatale kliniekverwijzingen door respectievelijk dr. Hui of dr. Shand. Tot deze vrouwen behoren (i) vrouwen met tekenen van primaire CMV-infectie bij de moeder tijdens de zwangerschap (ii) foetussen met structurele afwijkingen die wijzen op een aangeboren CMV-infectie (zoals vermeld in Hui L en Wood G. Perinatale uitkomst na primaire cytomegalovirusinfectie bij de moeder in het eerste trimester: een praktische update en advieshulp. 2015 Prenatale Diagnose; 35:1-7. ) Elke Engelssprekende vrouw van 18 jaar of ouder die in staat is geïnformeerde toestemming te geven, komt in aanmerking.

Proefpersonen met bevestigde foetale CMV-infectie zullen de casusgroep vormen. Foetussen zonder bewijs van aangeboren infectie vormen de controlegroep. Structureel abnormale foetussen die CMV-negatief zijn, worden uitgesloten van de analyse van de controlegroep. Het percentage geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde foetussen na maternale infectie is ongeveer 40%, dus we verwachten een redelijke verhouding van gevallen en controles voor onze beoogde steekproefomvang.

Het eerste contact zal worden gelegd door het klinische team, maar de follow-up door een onderzoeksvroedvrouw om de onderzoeksstudie in detail te bespreken zal plaatsvinden, hetzij telefonisch, hetzij face-to-face na het klinische overleg, waar mogelijk. Dit is om mogelijke conflicten te minimaliseren wanneer de clinicus toestemming van de patiënt voor het onderzoek moet verkrijgen. Patiënten zullen worden gerustgesteld dat ze niet verplicht zullen zijn om deel te nemen en dat hun beslissing geen invloed zal hebben op hun klinische zorg of relatie met hun behandelend arts Voorafgaand aan hun procedure zal schriftelijke, geïnformeerde toestemming van vrouwen worden verkregen en worden opgeslagen in een afgesloten dossier kabinet in de respectievelijke afdelingen Perinatale Geneeskunde.

Uitsluitingscriteria Vrouwen die geen toestemming geven, niet in staat zijn om toestemming te geven voor medische ingrepen, niet Engels sprekend of jonger zijn dan 18 jaar.

Statistische analyses Steekproefomvang In het algemeen geldt: hoe meer biologische replicatieonderzoeken (grotere steekproefomvang), hoe sterker de conclusies die kunnen worden getrokken uit de genexpressiegegevens. Biologische variatie tussen monsters en de verwachte spreiding van differentiële genexpressie zijn belangrijke factoren die de ideale steekproefomvang beïnvloeden. Voor deze studie weten de onderzoekers niet van tevoren hoe de genexpressieniveaus zouden worden verdeeld, waardoor ons vermogen om algoritmen voor steekproefomvang te gebruiken voor RNA-seq-experimenten wordt beperkt. Naast de hierboven besproken beperkingen op de beschikbaarheid van monsters, beperkten de hoge kosten die gepaard gaan met laboratoriumverwerking de haalbaarheid van het gebruik van grote aantallen AF-monsters.

De belangrijkste factoren die de formele berekeningen van de steekproefomvang voor RNA-sequencing-experimenten beïnvloeden, zijn: diepte van sequencing, variatiecoëfficiënt, omvang van gedetecteerde differentiële expressie, fout-positieve snelheid en vermogen. Uitgaande van een gemiddelde leesdiepte van 20, gelijk binnen de groep variatiecoëfficiënt van 0,4, een effectgrootte van 2 maal, 0,05 vals-positief percentage en 80% vermogen, is het vereiste aantal proefpersonen per groep 7,1. De onderzoekers streven daarom naar een minimaal doel van tien monsters per groep.

Analyse van differentiële genexpressie en functionele analyse Een bio-informatica-specialist binnen de Translational Obstetric Group zal beschikbaar zijn voor statistische en analytische ondersteuning van de genexpressiegegevens. Genen die significant ontregeld zijn in de CMV-geïnfecteerde gevallen in vergelijking met niet-geïnfecteerde controles zullen worden geïdentificeerd. Functionele analyses van de differentieel tot expressie gebrachte genen zullen worden uitgevoerd met behulp van Ingenuity Pathways Analysis (IPA) versie 9.0-software (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity is een handmatig samengestelde database die oververtegenwoordigde biologische processen in een bepaalde dataset identificeert en een significantiescore berekent voor elk resultaat met behulp van de Fisher's-test met rechtse staart. De onderzoekers zullen ook een openbaar beschikbare foetusspecifieke functionele annotatie "Developmental Functional Annotation at Tufts" (DFLAT) gebruiken, waarvan eerder is aangetoond dat deze de biologische interpretatie van perinatale datasets verbetert (//dflat.cs.tufts.edu).2