Opracowanie potencjalnych biomarkerów rozwoju mózgu płodu po wrodzonym zakażeniu CMV

Uzasadnienie badania Obecne narzędzia do prognozowania perinatalnego wyniku po zakażeniu płodu wirusem CMV są bardzo ograniczone. Amniopunkcja jest zwykle oferowana od 20 tygodnia ciąży w celu zdiagnozowania infekcji płodu. To pobieranie próbek daje możliwość zbadania nowych podejść do przewidywania wyniku okołoporodowego.

To badanie ma na celu opracowanie podejścia opartego na mRNA do badania wpływu CMV na rozwijający się płód. Praca doktorska dr Hui opierała się na badaniu mRNA płynu owodniowego jako „płynu podsumowującego” ekspresji genów płodu, który dostarcza znaczących informacji na temat rozwoju. Ta praca sugeruje, że informacje o rozwoju neurologicznym płodu można uzyskać z płynu owodniowego za pośrednictwem bezkomórkowych transkryptów specyficznych dla mózgu płodu (mRNA).

Jeśli kobieta zagrożona wrodzoną CMV zdecyduje się na wykonanie amniopunkcji w celu rozpoznania zakażenia płodu, pobranie próbki daje możliwość pobrania próbki AF do analizy RNA. Sekwencjonowanie RNA (RNAseq) to stosunkowo nowa technologia, która umożliwia szczegółową analizę genów, które ulegają aktywnej ekspresji („włączonej”) podczas określonego stanu chorobowego. Badacze zastosują metody sekwencjonowania RNA do płynu owodniowego w celu wyszukania potencjalnych różnic w ekspresji genów, które mogą pomóc w zrozumieniu choroby poprzez analizę funkcjonalną i identyfikację potencjalnych biomarkerów do przyszłych badań.

Hipoteza, że ​​płody zakażone CMV będą miały zmieniony profil ekspresji genów w porównaniu z płodami niezakażonymi, co stwierdzono w RNA bez komórek w płynie owodniowym.

Cele Przeprowadzenie analizy porównawczej całego transkryptomu AF RNA z płodów zakażonych i niezakażonych wirusem CMV przy użyciu technologii sekwencjonowania RNA.

Metody Będzie to wieloośrodkowe badanie z udziałem oddziałów medycyny płodowej w Melbourne (szpital Mercy dla kobiet), Sydney (szpital królewski dla kobiet, Randwick) i Leuven (UZ Leuven, Leuven). Badacze zamierzają zwerbować 20 kobiet (10 przypadków, 10 kontroli) w ciągu 2 lat.

Próbki będą pobierane podczas amniopunkcji ze wskazań klinicznych wykonywanej w celu rozpoznania obecności lub braku wrodzonej infekcji. Zwykle wykonuje się to w 20-21 tygodniu ciąży u kobiet z serokonwersją we wczesnej ciąży lub w czasie oceny płodu w przypadku skierowań z nieprawidłowościami strukturalnymi. Do badania wymagana byłaby objętość płynu owodniowego (AF) wynosząca 5-10 ml. Taka objętość próbki nie stanowi znacznego obciążenia dla lekarza wykonującego zabieg (jedynie 10-20 sekund dodatkowego czasu pobrania) i nie zwiększa ryzyka zabiegu dla kobiety w ciąży lub kobiety, ponieważ NIE ma konieczności dodatkowego wbijania igły (brak wzrostu poronienie lub wpływ na dobrostan płodu lub matki).

Próbka badawcza będzie przechowywana w oddzielnej fiolce do próbki klinicznej w odpowiednich miejscach rekrutacji. Jest przechowywany w 4 stopniach Celsjusza, a następnie wirowany przy 300 x g przez 10 minut w ciągu 6 godzin od pobrania. Supernatant AF zostanie usunięty i przechowywany w osobnej probówce. Zarówno część komórkowa, jak i supernatant zostaną zamrożone i przechowywane w temperaturze -80°C. Ośrodek rekrutacyjny w Sydney przetransportuje próbki suchym lodem do laboratorium Uniwersytetu w Melbourne w Mercy Hospital for Women, gdzie zostaną przetworzone. Wszystkie próbki otrzymają numer identyfikacyjny próbki badawczej przed transportem do laboratorium badawczego Uniwersytetu w Melbourne w Mercy Hospital for Women, aby chronić prywatność uczestników.

Całkowity RNA z próbek AF z 10 zakażonych CMV i 10 niezakażonych płodów, dobranych pod względem wieku ciążowego i płci płodu, zostanie przeanalizowany. Całkowity RNA zostanie wyekstrahowany z próbek supernatantu AF przy użyciu zestawu do ekstrakcji Qiagen Circulating Nucleic Acid. Przeprowadzona zostanie amplifikacja całego transkryptomu i sekwencjonowanie RNA RNA wolnego od komórek, a profile ekspresji grup przypadku i grup kontrolnych zostaną porównane w analizie par, jak przeprowadzono w poprzednich badaniach AF RNA. Do interpretacji biologicznej zostanie wykorzystana analiza szlaków genów o zróżnicowanej regulacji. Badacze wykorzystają zarówno szeroko stosowane oprogramowanie komercyjne (Ingenuity Pathway Analysis™), jak i specyficzne dla płodu narzędzie do analizy funkcjonalnej opracowane przez współpracowników z Tufts University (DFLAT).

Najbardziej regulowane w dół i w górę transkrypty mózgowe zostaną zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery nieprawidłowych wyników dla przyszłych badań walidacyjnych.

Wyniki ciąży do sześciu tygodni po porodzie dla matki i dziecka zostaną zebrane ze szpitalnej dokumentacji medycznej, w tym nieprawidłowości płodu wykryte na USG lub MRI, ciąża i sposób porodu, masa urodzeniowa, stosowanie terapii prenatalnych (immunoglobulina CMV lub inne), badania noworodków takie jak wyniki badań moczu/śliny/krwi pępowinowej, USG czaszki, badanie fizykalne i wyniki badań przesiewowych słuchu u noworodków.

Oczekiwane wyniki: W porównaniu z płodami niezakażonymi, płody zakażone CMV będą wykazywać zmienione ścieżki neurorozwojowe i ekspresję genów w analizie funkcjonalnej. Transkrypty specyficzne dla mózgu płodu, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w płodach zakażonych CMV, zostaną zidentyfikowane jako potencjalne biomarkery wyników neurorozwojowych do przyszłych badań walidacyjnych.

Przechowywanie i bezpieczeństwo danych Baza danych zostanie utworzona w ramach RedCap (Research Electronic Data Capture), bezpłatnej, bezpiecznej aplikacji internetowej zaprojektowanej w celu wspierania gromadzenia danych pacjentów na potrzeby badań naukowych. Usługa REDCap Uniwersytetu w Melbourne zapewnia zasady bezpiecznego przechowywania i tworzenia kopii zapasowych, które są zgodne ze standardami uniwersyteckimi oraz amerykańską ustawą o ochronie zdrowia i prywatności. Tylko badacze będą mieli dostęp do tej bazy danych.

Wydrukowane kopie formularzy zgody i inne informacje dotyczące badań będą przechowywane w zamkniętych szafkach na akta. Tylko badacze prowadzący badanie i HREC będą mieli dostęp do plików.

6.0 Kryteria włączenia Kobiety poddawane klinicznie wskazanej amniopunkcji z powodu podejrzenia wrodzonego zakażenia CMV przez Oddział Medycyny Perinatalnej w Mercy Hospital for Women lub Royal Hospital for Women, Randwick zostaną zidentyfikowane na podstawie skierowań z kliniki okołoporodowej odpowiednio przez dr Hui lub dr Shand. Do takich kobiet należą (i) kobiety z objawami pierwotnego zakażenia CMV u matki podczas ciąży (ii) płody z nieprawidłowościami strukturalnymi sugerującymi wrodzoną infekcję CMV (jak wymieniono w Hui L i Wood G. Wyniki okołoporodowe po zakażeniu matki pierwotnym wirusem cytomegalii w pierwszym trymestrze ciąży: praktyczna aktualizacja i pomoc doradcza. 2015 Diagnostyka prenatalna; 35:1-7. ) Każda anglojęzyczna kobieta w wieku co najmniej 18 lat, która jest zdolna do wyrażenia świadomej zgody, będzie się kwalifikować.

Osoby z potwierdzonym zakażeniem CMV płodu będą stanowić grupę przypadków. Płody bez oznak wrodzonej infekcji będą stanowić grupę kontrolną. Strukturalnie nieprawidłowe płody, które są CMV-ujemne, zostaną wykluczone z analizy grupy kontrolnej. Odsetek płodów zakażonych i niezakażonych po zakażeniu matki wynosi około 40%, więc przewidujemy rozsądny stosunek przypadków i kontroli dla naszej docelowej wielkości próby.

Wstępny kontakt zostanie nawiązany przez zespół kliniczny, ale położna prowadząca badania w celu szczegółowego omówienia badania zostanie nawiązana telefonicznie lub osobiście po konsultacji klinicznej, jeśli to możliwe. Ma to na celu zminimalizowanie potencjalnych konfliktów związanych z uzyskaniem przez klinicystów zgody pacjenta na badanie. Pacjenci zostaną zapewnieni, że nie będą zobowiązani do udziału i że ich decyzja nie wpłynie na ich opiekę kliniczną ani relacje z lekarzem prowadzącym. Pisemna, świadoma zgoda zostanie uzyskana od kobiet przed zabiegiem i będzie przechowywana w zamkniętym archiwum gabinetów w odpowiednich Oddziałach Medycyny Perinatalnej.

Kryteria wykluczenia Kobiety, które nie wyrażają zgody, które nie są zdolne do wyrażenia zgody na zabiegi medyczne, nie mówiące po angielsku lub mające mniej niż 18 lat.

Analizy statystyczne Wielkość próby Ogólnie rzecz biorąc, im więcej powtórzeń biologicznych (większy rozmiar próby), tym silniejsze wnioski można wyciągnąć z danych dotyczących ekspresji genów. Zróżnicowanie biologiczne między próbkami i oczekiwane rozprzestrzenianie się zróżnicowanej ekspresji genów to ważne czynniki wpływające na idealną wielkość próbki. W tym badaniu badacze nie wiedzą z góry, w jaki sposób rozkładałyby się poziomy ekspresji genów, co ogranicza naszą zdolność do stosowania algorytmów wielkości próbki do eksperymentów z sekwencją RNA. Oprócz omówionych powyżej ograniczeń dostępności próbek, wysokie koszty związane z przetwarzaniem laboratoryjnym ograniczały możliwość wykorzystania dużej liczby próbek AF.

Głównymi czynnikami wpływającymi na formalne obliczenia wielkości próbki dla eksperymentów z sekwencjonowaniem RNA są: głębokość sekwencjonowania, współczynnik zmienności, wielkość wykrytej ekspresji różnicowej, odsetek wyników fałszywie dodatnich i moc. Zakładając średnią głębokość odczytu równą 20, równy wewnątrzgrupowy współczynnik zmienności 0,4, wielkość efektu 2-krotną, odsetek wyników fałszywie dodatnich 0,05 i moc 80%, wymagana liczba osób na grupę wynosi 7,1. dziesięć próbek na grupę.

Analiza zróżnicowanej ekspresji genów i analiza funkcjonalna Konsultant-specjalista bioinformatyki w Translacyjnej Grupie Położniczej będzie dostępny w celu wsparcia statystycznego i analitycznego danych dotyczących ekspresji genów. Zidentyfikowane zostaną geny, które są znacząco rozregulowane w przypadkach zakażonych CMV w porównaniu z niezakażonymi kontrolami. Analizy funkcjonalne genów o różnej ekspresji zostaną przeprowadzone przy użyciu oprogramowania Ingenuity Pathways Analysis (IPA) w wersji 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity to ręcznie tworzona baza danych, która identyfikuje nadreprezentowane procesy biologiczne w danym zbiorze danych i oblicza wynik istotności dla każdego wyniku za pomocą prawostronnego testu Fishera. Badacze wykorzystają również publicznie dostępną adnotację funkcjonalną specyficzną dla płodu „Developmental FunctionaL Adnotation at Tufts” (DFLAT), która, jak wykazano wcześniej, poprawia biologiczną interpretację zbiorów danych okołoporodowych (http://dflat.cs.tufts.edu).2