선천성 CMV 감염 후 태아 뇌 발달을 위한 잠재적 바이오마커 개발

연구의 이론적 근거 태아가 CMV에 감염된 후 주산기 결과를 예측하기 위한 현재 도구는 매우 제한적입니다. 양수천자는 일반적으로 태아 감염을 진단하기 위해 임신 20주부터 제공됩니다. 이 샘플링은 주산기 결과를 예측하는 새로운 접근법을 조사할 수 있는 기회를 제공합니다.

이 연구는 발달 중인 태아에 대한 CMV의 영향을 연구하기 위한 mRNA 기반 접근법을 개발하는 것을 목표로 합니다. Hui 박사의 박사 논문은 발달에 대한 의미 있는 정보를 제공하는 태아의 "요약액"이라는 유전자 발현으로서 양수 mRNA에 대한 연구를 기반으로 합니다. 이 연구는 태아 신경 발달에 대한 정보가 세포가 없는 태아 뇌 특이 전사(mRNA)를 통해 양수에서 얻을 수 있음을 시사했습니다.

선천성 CMV의 위험이 있는 여성이 태아 감염 진단을 위해 양수천자를 선택하는 경우, 이 샘플링은 RNA 분석을 위해 AF의 분취량을 수집할 수 있는 기회를 제공합니다. RNA 시퀀싱(RNAseq)은 특정 질병 상태 동안 활발하게 발현('스위치 켜짐')되는 유전자의 상세한 분석을 가능하게 하는 비교적 새로운 기술입니다. 연구자들은 기능 분석을 통해 질병을 이해하고 향후 연구를 위한 후보 바이오마커를 식별하는 데 도움이 될 수 있는 잠재적 유전자 발현 차이를 찾기 위해 양수에 RNA 시퀀싱 방법을 적용할 것입니다.

가설 CMV에 감염된 태아는 양수 무세포 RNA에서 확인된 바와 같이 감염되지 않은 태아와 비교하여 변경된 유전자 발현 프로필을 가질 것입니다.

목표 RNA 시퀀싱 기술을 사용하여 CMV에 감염된 태아와 감염되지 않은 태아의 AF RNA에 대한 비교 전체 전사체 분석을 수행합니다.

방법 이 연구는 Melbourne(여성을 위한 Mercy 병원), Sydney(Randwick 여성을 위한 Royal 병원) 및 Leuven(UZ Leuven, Leuven)의 태아 의학 단위를 포함하는 다기관 연구입니다. 조사관은 2년 동안 20명의 여성(10건, 10건의 대조군)을 모집하는 것을 목표로 합니다.

샘플은 선천성 감염의 존재 또는 부재를 진단할 목적으로 수행되는 임상적으로 지시된 양수천자 동안 수집될 것입니다. 이것은 일반적으로 임신 초기에 혈청 전환이 있는 여성의 경우 임신 20-21주에 수행하거나 구조적 이상이 있는 위탁의 경우 태아 평가 시에 수행됩니다. 연구 연구에는 5-10ml의 양수(AF) 부피가 필요합니다. 이 샘플 양은 절차를 수행하는 임상의에게 상당한 부담을 주지 않으며(단지 10-20초의 추가 수집 시간) 추가 바늘 삽입이 없기 때문에 임신 또는 여성의 절차 위험을 증가시키지 않습니다(혈액 증가 없음). 유산 또는 태아 또는 산모의 건강에 미치는 영향).

연구 샘플은 각 모집 사이트에서 임상 샘플과 별도의 바이알에 보관됩니다. 섭씨 4도에서 보관한 후 수집 후 6시간 이내에 300 x g에서 10분간 원심분리합니다. AF 상등액은 떼어내어 별도의 튜브에 보관합니다. 세포 부분과 상청액은 모두 냉동되어 -80°C에서 보관됩니다. 시드니 모집 현장은 표본을 드라이아이스에 실은 머시 여성 병원의 멜버른 대학 실험실로 운반하여 처리할 것입니다. 모든 샘플은 참가자의 개인 정보를 보호하기 위해 Mercy Hospital for Women의 멜버른 대학교 연구실로 이송되기 전에 연구 샘플 ID 번호가 부여됩니다.

10명의 CMV 감염된 태아와 10명의 감염되지 않은 태아의 AF 샘플에서 재태 연령과 태아 성별이 일치하는 총 RNA를 분석합니다. Qiagen Circulating Nucleic Acid 추출 키트를 사용하여 AF 상청액 샘플에서 총 RNA를 추출합니다. 무세포 RNA의 전체 전사체 증폭 및 RNA-시퀀싱이 수행될 것이며 AF RNA의 이전 연구에서 수행된 것과 같이 쌍 분석에서 케이스 및 대조군의 발현 프로파일이 비교될 것이다. 차별적으로 조절되는 유전자의 경로 분석은 생물학적 해석에 사용될 것입니다. 연구자들은 널리 사용되는 상용 소프트웨어(Ingenuity Pathway Analysis™)와 Tufts University(DFLAT)의 공동 작업자가 개발한 태아별 기능 분석 도구를 모두 사용할 것입니다.

가장 하향 및 상향 조절된 뇌 전사물은 향후 검증 연구를 위한 비정상적인 결과의 후보 바이오마커로 식별될 것입니다.

초음파 또는 MRI에서 발견된 태아 이상, 임신 및 출산 방식, 출생 체중, 산전 요법(CMV 면역글로불린 또는 기타) 사용, 신생아 조사를 포함하여 산모와 아기의 산후 6주까지의 임신 결과는 병원 의료 기록에서 수집됩니다. 소변/타액/제대혈 검사 결과, 두개골 초음파, 신체 검사 및 신생아 청력 검사 결과 등.

기대 결과: 감염되지 않은 태아와 비교하여 CMV에 감염된 태아는 기능 분석에서 변경된 신경 발달 경로 및 유전자 발현을 보일 것입니다. CMV에 감염된 태아에서 차등적으로 발현되는 태아 뇌 특이적 전사체는 향후 검증 연구를 위한 신경 발달 결과의 후보 바이오마커로 식별될 것입니다.

데이터 저장 및 보안 데이터베이스는 연구 연구를 위한 환자 데이터 캡처를 지원하도록 설계된 무료 보안 웹 기반 애플리케이션인 RedCap(Research Electronic Data Capture) 내에 설정됩니다. University of Melbourne REDCap 서비스는 대학 표준과 미국 건강 정보 및 개인 정보 보호법을 준수하는 안전한 스토리지 및 백업 정책을 제공합니다. 연구 조사자만 이 데이터베이스에 액세스할 수 있습니다.

동의서 및 기타 연구 정보의 인쇄본은 잠긴 서류 캐비넷에 보관됩니다. 연구 조사관과 HREC만 파일에 액세스할 수 있습니다.

6.0 포함 기준 Mercy Hospital for Women 또는 Royal Hospital for Women, Randwick의 주산기 의학과를 통해 선천성 CMV 감염이 의심되는 경우 임상적으로 양수천자 검사를 받는 여성은 각각 Dr Hui 또는 Dr Shand의 주산기 클리닉 의뢰에서 식별됩니다. 이러한 여성은 (i) 임신 중 모계 일차 CMV 감염의 증거가 있는 여성 (ii) 선천적 CMV 감염을 시사하는 구조적 이상이 있는 태아(Hui L 및 Wood G에 나열됨. 임신 초기에 산모 일차 시토메갈로바이러스 감염 후 주산기 결과: 실용적인 업데이트 및 상담 지원. 2015 산전 진단; 35:1-7. ) 정보에 입각한 동의를 할 수 있는 18세 이상의 모든 영어권 여성이 자격이 있습니다.

태아 CMV 감염이 확인된 피험자는 사례 그룹을 구성합니다. 선천성 감염의 증거가 없는 태아가 대조군을 구성합니다. CMV 음성인 구조적으로 비정상적인 태아는 대조군 분석에서 제외됩니다. 산모 감염 후 감염된 태아와 감염되지 않은 태아의 비율은 약 40%이므로 대상 샘플 크기에 대한 사례 및 통제의 합리적인 비율을 예상합니다.

초기 접촉은 임상 팀에서 이루어지지만 가능한 한 임상 상담 후 전화 또는 대면을 통해 연구 조사에 대해 자세히 논의하기 위해 연구 조산사가 후속 조치를 취할 것입니다. 이는 임상의가 연구에 대한 환자의 동의를 얻음으로써 잠재적인 충돌을 최소화하기 위한 것입니다. 환자는 참여할 의무가 없으며 그들의 결정이 임상 치료 또는 치료 의사와의 관계에 영향을 미치지 않는다는 점에서 안심할 수 있습니다. 절차에 앞서 여성으로부터 사전 서면 동의를 얻고 잠금 파일에 저장됩니다. 주 산기 의학의 각 부서의 내각.

제외 기준 동의하지 않는 여성, 의료 시술에 대한 동의 능력이 없는 여성, 비영어권 여성 또는 18세 미만 여성.

통계 분석 샘플 크기 일반적으로 생물학적 복제가 많을수록(샘플 크기가 클수록) 유전자 발현 데이터에서 추론할 수 있는 것이 더 강해집니다. 표본 간의 생물학적 변이와 차등 유전자 발현의 예상 확산은 이상적인 표본 크기에 영향을 미치는 중요한 요소입니다. 이 연구에서 연구자들은 유전자 발현 수준이 어떻게 분포될지 미리 알지 못하므로 RNA-seq 실험에 샘플 크기 알고리즘을 사용하는 능력이 제한됩니다. 위에서 논의한 샘플 가용성에 대한 제한 외에도 실험실 처리와 관련된 높은 비용으로 인해 많은 수의 AF 샘플을 사용할 가능성이 제한되었습니다.

RNA 시퀀싱 실험을 위한 공식 샘플 크기 계산에 영향을 미치는 주요 요인은 시퀀싱 깊이, 변동 계수, 감지된 차등 발현의 크기, 위양성률 및 검정력입니다. 평균 읽기 깊이 20, 그룹 내 변동 계수 0.4, 효과 크기 2배, 위양성률 0.05, 검정력 80%라고 가정할 때 필요한 그룹당 피험자 수는 7.1입니다. 따라서 조사관은 최소 목표를 목표로 합니다. 그룹당 10개의 샘플.

차등 유전자 발현 분석 및 기능 분석 Translational Obstetric Group 내의 컨설턴트 생물정보학 전문가는 유전자 발현 데이터에 대한 통계 및 분석 지원을 위해 사용할 수 있습니다. 감염되지 않은 대조군과 비교하여 CMV 감염 사례에서 현저하게 조절 장애가 있는 유전자가 확인될 것이다. 차별적으로 발현된 유전자의 기능적 분석은 Ingenuity Pathways Analysis(IPA) 버전 9.0 소프트웨어(Ingenuity; Redwood City, CA)를 사용하여 수행될 것이다. Ingenuity는 주어진 데이터 세트에서 과도하게 표현된 생물학적 과정을 식별하고 오른쪽 꼬리 피셔 테스트를 사용하여 각 결과에 대한 유의성 점수를 계산하는 수동으로 선별된 데이터베이스입니다. 연구자들은 또한 이전에 주산기 데이터세트의 생물학적 해석을 향상시키는 것으로 밝혀진 공개적으로 이용 가능한 태아 관련 기능 주석 "DFLAT(Developmental FunctionaL Annotation at Tufts)"를 사용할 것입니다(http://dflat.cs.tufts.edu).2