Разработка потенциальных биомаркеров развития головного мозга плода после врожденной ЦМВ-инфекции

Обоснование исследования Существующие инструменты для прогнозирования перинатального исхода после инфицирования плода ЦМВ очень ограничены. Амниоцентез обычно предлагается с 20 недель беременности для диагностики внутриутробной инфекции. Эта выборка дает возможность исследовать новые подходы к прогнозированию перинатального исхода.

Это исследование направлено на разработку подхода на основе мРНК к изучению воздействия ЦМВ на развивающийся плод. Докторская диссертация доктора Хуи была основана на изучении мРНК амниотической жидкости как экспрессии гена «суммарной жидкости» плода, которая дает значимую информацию о развитии. В этой работе предполагалось, что информацию о развитии нервной системы плода можно получить из амниотической жидкости с помощью бесклеточных специфических транскриптов головного мозга плода (мРНК).

Если женщина с риском врожденного ЦМВ выбирает амниоцентез для диагностики внутриутробной инфекции, этот забор дает возможность собрать аликвоту АЖ для анализа РНК. Секвенирование РНК (RNAseq) — относительно новая технология, позволяющая детально анализировать гены, которые активно экспрессируются («включаются») во время определенного болезненного состояния. Исследователи будут применять методы секвенирования РНК к амниотической жидкости для поиска потенциальных различий в экспрессии генов, которые могут помочь в понимании болезни с помощью функционального анализа и определения биомаркеров-кандидатов для будущих исследований.

Гипотеза. Плоды, инфицированные ЦМВ, будут иметь измененный профиль экспрессии генов по сравнению с неинфицированными плодами, что подтверждается бесклеточной РНК амниотической жидкости.

Цели Провести сравнительный анализ полного транскриптома РНК AF от ЦМВ-инфицированных и неинфицированных плодов с использованием технологии секвенирования РНК.

Методы Это будет многоцентровое исследование с участием отделений фетальной медицины в Мельбурне (Женская больница Милосердия), Сиднее (Королевская женская больница, Рандвик) и Левене (UZ Leuven, Левен). Исследователи стремятся набрать 20 женщин (10 случаев, 10 контролей) в течение 2 лет.

Образцы будут собираться во время клинически показанного амниоцентеза, проводимого с целью диагностики наличия или отсутствия врожденной инфекции. Это обычно выполняется на 20-21 неделе беременности у женщин с сероконверсией на ранних сроках беременности или во время оценки плода в случаях направления к специалистам со структурными аномалиями. Для исследования потребуется амниотическая жидкость (АЖ) объемом 5-10 мл. Этот объем пробы не представляет значительной нагрузки для клинициста, проводящего процедуру (всего 10-20 секунд дополнительного времени сбора), и не увеличивает риск процедуры для беременной или женщины, поскольку НИКАКОЕ дополнительное введение иглы (нет увеличения выкидыш или влияние на благополучие плода или матери).

Образец для исследования будет храниться в отдельном флаконе от клинического образца в соответствующих центрах набора. Его хранят при 4 градусах Цельсия, а затем центрифугируют при 300 x g в течение 10 минут в течение 6 часов после сбора. Супернатант AF будет взят и сохранен в отдельной пробирке. Как клеточную часть, так и супернатант замораживают и хранят при температуре -80°C. Центр набора в Сиднее доставит образцы в лабораторию Мельбурнского университета в женской больнице Милосердия на сухом льду, где они будут обработаны. Всем образцам будет присвоен идентификационный номер исследуемого образца перед транспортировкой в ​​исследовательскую лабораторию Мельбурнского университета в больнице милосердия для женщин, чтобы защитить конфиденциальность участников.

Будет проанализирована общая РНК из образцов AF от 10 инфицированных ЦМВ и 10 неинфицированных плодов, соответствующих гестационному возрасту и полу плода. Суммарная РНК будет извлечена из образцов супернатанта AF с использованием набора для выделения циркулирующих нуклеиновых кислот Qiagen. Будут проведены амплификация всего транскриптома и секвенирование РНК внеклеточной РНК, а профили экспрессии в группе случая и контрольной группе будут сравниваться в парном анализе, как это было выполнено в предыдущих исследованиях РНК AF. Анализ путей дифференциально регулируемых генов будет использоваться для биологической интерпретации. Исследователи будут использовать как широко используемое коммерческое программное обеспечение (Ingenuity Pathway Analysis™), так и инструмент функционального анализа плода, разработанный сотрудниками Университета Тафтса (DFLAT).

Транскрипты головного мозга с наибольшей подавляющей и повышающей регуляцией будут идентифицированы как биомаркеры-кандидаты аномального исхода для будущих проверочных исследований.

Исходы беременности до шести недель после родов для матери и ребенка будут собраны из медицинской карты больницы, включая аномалии плода, обнаруженные при УЗИ или МРТ, срок беременности и способ родов, массу тела при рождении, использование пренатальной терапии (ЦМВ-иммуноглобулин или другое), обследования новорожденных. такие как результаты анализов мочи/слюны/пуповинной крови, УЗИ черепа, физикальное обследование и результаты скрининга слуха новорожденных.

Ожидаемые результаты: по сравнению с неинфицированными плодами, у плодов, инфицированных ЦМВ, будут обнаружены измененные пути развития нервной системы и экспрессия генов при функциональном анализе. Специфические транскрипты головного мозга плода, которые по-разному экспрессируются у плодов, инфицированных ЦМВ, будут идентифицированы в качестве биомаркеров-кандидатов исхода развития нервной системы для будущих проверочных исследований.

Хранение и безопасность данных База данных будет создана в рамках RedCap (Research Electronic Data Capture), бесплатного безопасного веб-приложения, предназначенного для поддержки сбора данных о пациентах для научных исследований. Служба REDCap Мельбурнского университета предоставляет политики безопасного хранения и резервного копирования, соответствующие университетским стандартам и Закону США о медицинской информации и конфиденциальности. Только исследователи исследования будут иметь доступ к этой базе данных.

Печатные копии форм согласия и другая информация об исследовании будут храниться в запирающихся шкафах для документов. Только исследователи исследования и HREC будут иметь доступ к файлам.

6.0 Критерии включения Женщины, которым проводится амниоцентез по клиническим показаниям по поводу подозрения на врожденную ЦМВ-инфекцию в отделении перинатальной медицины Женской больницы Милосердия или Королевской женской больницы Рандвик, будут определены по направлениям перинатальной клиники доктором Хуи или доктором Шандом соответственно. Эти женщины будут включать (i) женщин с признаками первичной ЦМВ-инфекции у матери во время беременности (ii) плода со структурными аномалиями, свидетельствующими о врожденной ЦМВ-инфекции (как указано в Hui L и Wood G. Перинатальный исход после первичной цитомегаловирусной инфекции у матери в первом триместре: практическое обновление и консультационная помощь. 2015 Пренатальная диагностика; 35:1-7. ) Любая англоговорящая женщина в возрасте 18 лет и старше, способная дать информированное согласие, будет иметь право на участие.

Субъекты с подтвержденной внутриутробной ЦМВ-инфекцией образуют группу случаев. Плоды без признаков врожденной инфекции образуют контрольную группу. Структурно аномальные плоды, отрицательные по ЦМВ, будут исключены из анализа контрольной группы. Уровень инфицированных и неинфицированных плодов после инфицирования матери составляет примерно 40%, поэтому мы ожидаем разумное соотношение случаев и контроля для нашего целевого размера выборки.

Первоначальный контакт будет установлен клинической командой, но последующая акушерка-исследователь для подробного обсуждения исследования будет проведена либо по телефону, либо лично после клинической консультации, где это возможно. Это делается для того, чтобы свести к минимуму потенциальные конфликты, связанные с получением клиницистами согласия пациента на исследование. Пациенты будут заверены, что они не будут обязаны участвовать и что их решение не повлияет на их клиническое лечение или отношения с лечащим врачом Письменное информированное согласие будет получено от женщин до процедуры и будет храниться в закрытой папке кабинет в соответствующих отделениях перинатальной медицины.

Критерии исключения Женщины, которые не дают согласия, не могут дать согласие на медицинские процедуры, не говорят по-английски или моложе 18 лет.

Статистический анализ Размер выборки Как правило, чем больше биологических повторов (больше размер выборки), тем более убедительные выводы можно сделать на основе данных об экспрессии генов. Биологические различия между образцами и ожидаемое распространение дифференциальной экспрессии генов являются важными факторами, влияющими на идеальный размер выборки. Для этого исследования исследователи не знают заранее, как будут распределяться уровни экспрессии генов, что ограничивает нашу возможность использовать алгоритмы размера выборки для экспериментов по секвенированию РНК. В дополнение к ограничениям на доступность образцов, описанным выше, высокие затраты, связанные с лабораторной обработкой, ограничивали возможность использования большого количества образцов AF.

Основными факторами, влияющими на формальные расчеты размера выборки для экспериментов по секвенированию РНК, являются: глубина секвенирования, коэффициент вариации, величина обнаруженного дифференциального выражения, частота и мощность ложноположительных результатов. Предполагая, что средняя глубина считывания равна 20, равный внутригрупповой коэффициент вариации 0,4, размер эффекта 2 раза, частота ложноположительных результатов 0,05 и мощность 80%, требуемое количество испытуемых в группе составляет 7,1. Таким образом, исследователи стремятся к минимальной цели по десять образцов на группу.

Анализ дифференциальной экспрессии генов и функциональный анализ Консультант-специалист по биоинформатике в рамках Трансляционной акушерской группы будет доступен для статистической и аналитической поддержки данных экспрессии генов. Будут идентифицированы гены, регуляция которых значительно нарушена в случаях инфицирования ЦМВ по сравнению с неинфицированным контролем. Функциональный анализ дифференциально экспрессируемых генов будет проводиться с использованием программного обеспечения Ingenuity Pathways Analysis (IPA) версии 9.0 (Ingenuity; Редвуд-Сити, Калифорния). Ingenuity — это созданная вручную база данных, которая выявляет чрезмерно представленные биологические процессы в заданном наборе данных и вычисляет показатель значимости для каждого результата с использованием правостороннего критерия Фишера. Исследователи также будут использовать общедоступную функциональную аннотацию, специфичную для плода, «Функциональная аннотация развития на пучках» (DFLAT), которая, как было показано ранее, улучшает биологическую интерпретацию наборов перинатальных данных (http://dflat.cs.tufts.edu)2.