Udvikling af potentielle biomarkører for føtal hjerneudvikling efter medfødt CMV-infektion

Begrundelse for undersøgelsen De nuværende værktøjer til forudsigelse af perinatalt udfald efter føtal infektion med CMV er meget begrænsede. Fostervandsprøver tilbydes normalt fra 20 ugers graviditet for at diagnosticere fosterinfektion. Denne prøvetagning giver mulighed for at undersøge nye tilgange til at forudsige perinatale udfald.

Denne undersøgelse har til formål at udvikle en mRNA-baseret tilgang til at studere virkningen af ​​CMV på det udviklende foster. Dr. Huis ph.d.-afhandling var baseret på undersøgelsen af ​​fostervands-mRNA som et genekspression "sammendragsvæske" af fosteret, der giver meningsfuld information om udvikling. Dette arbejde antydede, at information om føtal neuroudvikling kan opnås fra fostervand via cellefri føtale hjernespecifikke transkripter (mRNA'er).

Hvis en kvinde med risiko for medfødt CMV vælger at få foretaget en fostervandsprøve til diagnosticering af føtal infektion, giver denne prøveudtagning mulighed for at indsamle en alikvot af AF til RNA-analyse. RNA-sekventering (RNAseq) er en relativt ny teknologi, der muliggør detaljeret analyse af de gener, der aktivt udtrykkes ('tændt') under en bestemt sygdomstilstand. Efterforskerne vil anvende RNA-sekventeringsmetoder til fostervand for at søge efter potentielle genekspressionsforskelle, der kan hjælpe med at forstå sygdommen gennem funktionel analyse og identificering af kandidat-biomarkører til fremtidige undersøgelser.

Hypotese om, at fostre inficeret med CMV vil have en ændret genekspressionsprofil sammenlignet med ikke-inficerede fostre, som konstateret i fostervandscellefrit RNA.

Mål At udføre sammenlignende hel transkriptomanalyse af AF RNA fra CMV-inficerede og uinficerede fostre ved hjælp af RNA-sekventeringsteknologi.

Metoder Dette vil være et multicenterstudie, der involverer føtale medicinske enheder i Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) og Leuven (UZ Leuven, Leuven). Efterforskerne sigter mod at rekruttere 20 kvinder (10 sager, 10 kontroller) over 2 år.

Prøver vil blive indsamlet under klinisk indiceret amniocentese udført med det formål at diagnosticere tilstedeværelse eller fravær af medfødt infektion. Dette udføres normalt ved 20-21 svangerskabsuge for kvinder med serokonversion tidligt i graviditeten, eller på tidspunktet for fostervurdering i tilfælde af henvisninger med strukturelle abnormiteter. Et fostervandsvolumen (AF) på 5-10 ml ville være påkrævet til forskningsstudiet. Denne prøvevolumen udgør ikke en væsentlig byrde for klinikeren, der udfører proceduren (kun 10-20 sekunder ekstra opsamlingstid) og øger ikke risikoen for proceduren for graviditeten eller kvinden, da der IKKE er nogen yderligere kanyleindsættelse (ingen stigning i abort eller indvirkning på fosterets eller moderens velbefindende).

Forskningsprøven vil blive opbevaret i et separat hætteglas til den kliniske prøve på de respektive rekrutteringssteder. Det opbevares ved 4 grader Celsius og centrifugeres derefter ved 300 x g i 10 minutter inden for 6 timer efter opsamling. AF-supernatanten tages af og opbevares i et separat rør. Både den cellulære del og supernatanten vil blive frosset og opbevaret ved -80°C. Sydney rekrutteringsstedet vil transportere prøverne til University of Melbourne laboratoriet på Mercy Hospital for Women på tøris, hvor de vil blive behandlet. Alle prøver vil få et undersøgelsesprøve-id-nummer før transport til University of Melbourne forskningslaboratorium på Mercy Hospital for Women for at beskytte deltagernes privatliv.

Totalt RNA fra AF-prøver fra 10 CMV-inficerede og 10 uinficerede fostre, matchet for svangerskabsalder og føtalt køn, vil blive analyseret. Totalt RNA vil blive ekstraheret fra AF-supernatantprøverne vil blive udført ved hjælp af Qiagen Circulating Nucleic Acid-ekstraktionssættet. Hel transkriptomamplifikation og RNA-sekventering af det cellefrie RNA vil blive udført, og ekspressionsprofilerne for case- og kontrolgrupperne sammenlignes i en parret analyse som udført i tidligere undersøgelser af AF RNA. Pathway-analyse af de differentielt regulerede gener vil blive brugt til den biologiske fortolkning. Efterforskerne vil anvende både udbredt kommerciel software (Ingenuity Pathway Analysis™) og et fosterspecifikt funktionelt analyseværktøj udviklet af samarbejdspartnere ved Tufts University (DFLAT).

De mest ned- og opregulerede hjernetransskriptioner vil blive identificeret som kandidatbiomarkører for unormalt udfald til fremtidige valideringsstudier.

Graviditetsresultater til seks uger efter fødslen for mor og baby vil blive indsamlet fra hospitalets journal, herunder føtale abnormiteter påvist ved ultralyd eller MR, graviditet og fødselsmåde, fødselsvægt, brug af prænatale terapier (CMV-immunoglobulin eller andet), undersøgelser af nyfødte såsom urin/spyt/navlestrengsblodprøveresultater, kraniel ultralyd, fysisk undersøgelse og resultater af nyfødt hørescreening.

Forventede resultater: Sammenlignet med uinficerede fostre vil CMV-inficerede fostre vise ændrede neuroudviklingsveje og genekspression ved funktionel analyse. Foster-hjerne-specifikke transkripter, der er differentielt udtrykt i CMV-inficerede fostre, vil blive identificeret som kandidat-biomarkører for neuroudviklingsresultater til fremtidige valideringsundersøgelser.

Datalagring og sikkerhed Databasen vil blive sat op i RedCap (Research Electronic Data Capture), en gratis, sikker, webbaseret applikation designet til at understøtte patientdataindsamling til forskningsstudier. University of Melbourne REDCap-tjenesten leverer sikker opbevaring og sikkerhedskopiering, der overholder universitetets standarder og USA's Health Information and Privacy Act. Kun undersøgelsens efterforskere vil have adgang til denne database.

Papirkopier af samtykkeerklæringer og andre undersøgelsesoplysninger vil blive opbevaret i aflåste arkivskabe. Kun undersøgelsens efterforskere og HREC vil have adgang til filerne.

6.0 Inklusionskriterier Kvinder, der gennemgår klinisk indiceret amniocentese for mistanke om medfødt CMV-infektion gennem afdelingen for perinatal medicin på Mercy Hospital for Women eller Royal Hospital for Women, Randwick, vil blive identificeret ud fra de perinatale klinikhenvisninger af henholdsvis Dr. Hui eller Dr. Shand. Disse kvinder vil omfatte (i) kvinder med tegn på maternel primær CMV-infektion under graviditet (ii) Fostre med strukturelle abnormiteter, der tyder på medfødt CMV-infektion (som anført i Hui L og Wood G. Perinatalt udfald efter maternel primær cytomegalovirusinfektion i første trimester: en praktisk opdaterings- og rådgivningshjælp. 2015 Prænatal diagnose; 35:1-7. ) Enhver engelsktalende kvinde på 18 år eller derover, som er i stand til at give informeret samtykke, vil være berettiget.

Forsøgspersoner med bekræftet føtal CMV-infektion vil udgøre casegruppen. Fostre uden tegn på medfødt infektion vil udgøre kontrolgruppen. Strukturelt unormale fostre, der er CMV-negative, vil blive udelukket fra kontrolgruppeanalysen. Andelen af ​​inficerede kontra ikke-inficerede fostre efter maternel infektion er cirka 40 %, så vi forventer et rimeligt forhold mellem tilfælde og kontroller for vores målprøvestørrelse.

Indledende kontakt vil blive taget af det kliniske team, men opfølgning af en forskningsjordemoder for at diskutere forskningsstudiet i detaljer vil blive foretaget, enten telefonisk eller ansigt til ansigt efter den kliniske konsultation, hvor det er muligt. Dette er for at minimere potentielle konflikter fra at få klinikerne til at indhente patientens samtykke til undersøgelsen. Patienter vil blive forsikret om, at de ikke er forpligtet til at deltage, og at deres beslutning ikke vil påvirke deres kliniske pleje eller forhold til deres behandlende læge. Der vil blive indhentet skriftligt informeret samtykke fra kvinder før deres procedure og opbevares i en låst arkivering. kabinet i de respektive afdelinger for Perinatal Medicin.

Eksklusionskriterier Kvinder, der ikke giver samtykke, som ikke er i stand til at give samtykke til medicinske procedurer, ikke-engelsktalende, eller som er under 18 år.

Statistiske analyser Prøvestørrelse Generelt gælder det, at jo flere biologiske replikater (større prøvestørrelse), jo stærkere slutninger kan der drages fra genekspressionsdataene. Biologisk variation mellem prøver og den forventede spredning af differentiel genekspression er vigtige faktorer, der påvirker den ideelle prøvestørrelse. Til denne undersøgelse ved efterforskerne ikke på forhånd, hvordan genekspressionsniveauerne vil blive fordelt, hvilket begrænser vores evne til at bruge prøvestørrelsesalgoritmer til RNA-seq-eksperimenter. Ud over begrænsningerne for prøvetilgængelighed diskuteret ovenfor, begrænsede de høje omkostninger forbundet med laboratoriebehandling muligheden for at bruge et stort antal AF-prøver.

De vigtigste faktorer, der påvirker formelle prøvestørrelsesberegninger for RNA-sekventeringseksperimenter, er: sekventeringsdybde, variationskoefficient, størrelsen af ​​detekteret differentiel ekspression, falsk positiv hastighed og effekt. Forudsat en gennemsnitlig læsedybde på 20, lig inden for gruppevariationskoefficienten på 0,4, en effektstørrelse på 2 gange, 0,05 falsk positive rate og 80 % power, er antallet af forsøgspersoner pr. gruppe påkrævet 7,1. Efterforskerne sigter derfor mod et minimumsmål på ti prøver pr. gruppe.

Analyse af differentiel genekspression og funktionel analyse En konsulent bioinformatikspecialist inden for Translational Obstetric Group vil være tilgængelig for statistisk og analyseunderstøttelse af genekspressionsdataene. Gener, der er signifikant dysregulerede i de CMV-inficerede tilfælde sammenlignet med ikke-inficerede kontroller, vil blive identificeret. Funktionelle analyser af de differentielt udtrykte gener vil blive udført ved hjælp af Ingenuity Pathways Analysis (IPA) version 9.0 software (Ingenuity; Redwood City, CA). Opfindsomhed er en manuelt kureret database, der identificerer overrepræsenterede biologiske processer i et givet datasæt og beregner en signifikansscore for hvert resultat ved hjælp af den højrehalede Fishers test. Efterforskerne vil også bruge en offentligt tilgængelig fosterspecifik funktionel annotation "Developmental Functional Annotation at Tufts" (DFLAT), som tidligere har vist sig at forbedre den biologiske fortolkning af perinatale datasæt (http://dflat.cs.tufts.edu).2