Vývoj potenciálních biomarkerů pro vývoj fetálního mozku po vrozené CMV infekci

Odůvodnění studie Současné nástroje pro predikci perinatálního výsledku po infekci plodu CMV jsou velmi omezené. Amniocentéza se obvykle nabízí od 20. týdne těhotenství k diagnostice infekce plodu. Tento odběr vzorků poskytuje příležitost prozkoumat nové přístupy k predikci perinatálního výsledku.

Tato studie si klade za cíl vyvinout přístup založený na mRNA ke studiu dopadu CMV na vyvíjející se plod. Disertační práce Dr Hui byla založena na studiu mRNA plodové vody jako genové exprese „souhrnné tekutiny“ plodu, která poskytuje smysluplné informace o vývoji. Tato práce naznačuje, že informace o neurovývoji plodu lze získat z plodové vody prostřednictvím bezbuněčných fetálních mozkových specifických transkriptů (mRNA).

Pokud se žena s rizikem vrozené CMV rozhodne pro amniocentézu pro diagnostiku fetální infekce, tento odběr poskytuje příležitost odebrat alikvot AF pro analýzu RNA. RNA sekvenování (RNAseq) je relativně nová technologie, která umožňuje podrobnou analýzu genů, které jsou aktivně exprimovány („zapnuty“) během určitého chorobného stavu. Vyšetřovatelé použijí metody sekvenování RNA na plodovou vodu, aby hledali potenciální rozdíly v genové expresi, které mohou pomoci při pochopení onemocnění prostřednictvím funkční analýzy a identifikace kandidátních biomarkerů pro budoucí studie.

Hypotéza, že plody infikované CMV budou mít změněný profil genové exprese ve srovnání s neinfikovanými plody, jak bylo zjištěno u RNA bez buněk plodové vody.

Cíle Provést komparativní analýzu celého transkriptomu AF RNA z plodů infikovaných a neinfikovaných CMV pomocí technologie sekvenování RNA.

Metody Půjde o multicentrickou studii zahrnující jednotky fetální medicíny v Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) a Leuven (UZ Leuven, Leuven). Cílem vyšetřovatelů je získat 20 žen (10 případů, 10 kontrol) během 2 let.

Vzorky budou odebírány během klinicky indikované amniocentézy prováděné za účelem diagnostiky přítomnosti nebo nepřítomnosti vrozené infekce. To se obvykle provádí ve 20.–21. týdnu těhotenství u žen se sérokonverzí v časném těhotenství nebo v době hodnocení plodu v případech doporučení se strukturálními abnormalitami. Pro výzkumnou studii by byl vyžadován objem plodové vody (AF) 5-10 ml. Tento objem vzorku nepředstavuje významnou zátěž pro lékaře provádějícího zákrok (pouze 10–20 sekund navíc doba odběru) a nezvyšuje riziko zákroku pro těhotenství nebo ženu, protože NENÍ ŽÁDNÉ dodatečné zavedení jehly (žádné zvýšení potrat nebo dopad na blaho plodu nebo matky).

Výzkumný vzorek bude uložen v oddělené lahvičce ke klinickému vzorku na příslušných náborových místech. Skladuje se při 4 stupních Celsia a poté se centrifuguje při 300 x g po dobu 10 minut do 6 hodin od odběru. Supernatant AF bude odebrán a uložen v samostatné zkumavce. Jak buněčná část, tak supernatant budou zmrazeny a skladovány při -80 °C. Náborové místo v Sydney dopraví vzorky na suchém ledu do laboratoře University of Melbourne v Mercy Hospital for Women, kde budou zpracovány. Všem vzorkům bude před přepravou do výzkumné laboratoře University of Melbourne v Mercy Hospital for Women přiděleno identifikační číslo studijního vzorku, aby bylo chráněno soukromí účastníků.

Bude analyzována celková RNA ze vzorků AF z 10 CMV infikovaných a 10 neinfikovaných plodů, odpovídajících gestačnímu věku a pohlaví plodu. Celková RNA bude extrahována ze vzorků supernatantu AF bude provedena pomocí extrakční soupravy Qiagen Circulating Nucleic Acid. Bude provedena amplifikace celého transkriptomu a RNA-sekvenování RNA bez buněk a expresní profily případové a kontrolní skupiny budou porovnány v párové analýze, jak bylo provedeno v předchozích studiích AF RNA. Pro biologickou interpretaci bude použita analýza dráhy diferencovaně regulovaných genů. Vyšetřovatelé použijí jak široce používaný komerční software (Ingenuity Pathway Analysis™), tak nástroj funkční analýzy specifický pro plod vyvinutý spolupracovníky na Tufts University (DFLAT).

Nejvíce down- a up-regulované mozkové transkripty budou identifikovány jako kandidátní biomarkery abnormálního výsledku pro budoucí validační studie.

Výsledky těhotenství do šesti týdnů po porodu pro matku a dítě budou shromážděny z nemocničního lékařského záznamu, včetně abnormalit plodu zjištěných na ultrazvuku nebo MRI, gestace a způsobu porodu, porodní hmotnosti, použití prenatálních terapií (CMV imunoglobulin nebo jiné), vyšetření novorozenců jako jsou výsledky testů moči/slin/pupečníkové krve, lebeční ultrazvuk, fyzikální vyšetření a výsledky novorozeneckého screeningu sluchu.

Očekávané výsledky: Ve srovnání s neinfikovanými plody budou plody infikované CMV při funkční analýze vykazovat změněné neurovývojové dráhy a genovou expresi. Fetálně-mozkové specifické transkripty, které jsou rozdílně exprimovány u plodů infikovaných CMV, budou identifikovány jako kandidátní biomarkery neurovývojového výsledku pro budoucí validační studie.

Ukládání a zabezpečení dat Databáze bude zřízena v rámci RedCap (Research Electronic Data Capture), bezplatné, zabezpečené webové aplikace určené k podpoře sběru dat pacientů pro výzkumné studie. Služba REDCap University of Melbourne poskytuje zásady bezpečného úložiště a zálohování, které jsou v souladu s univerzitními standardy a se zákonem Spojených států o zdravotních informacích a ochraně osobních údajů. Do této databáze budou mít přístup pouze výzkumní pracovníci.

Tištěné kopie formulářů souhlasu a další studijní informace budou uchovávány v uzamčených kartotékách. Ke spisům budou mít přístup pouze vyšetřovatelé studie a HREC.

6.0 Kritéria zařazení Ženy podstupující klinicky indikovanou amniocentézu pro podezření na vrozenou CMV infekci prostřednictvím oddělení perinatální medicíny v Mercy Hospital for Women nebo Royal Hospital for Women, Randwick budou identifikovány na základě doporučení z perinatální kliniky Dr. Hui nebo Dr. Shand. Tyto ženy budou zahrnovat (i) ženy s prokázanou primární CMV infekcí matky během těhotenství (ii) Plody se strukturálními abnormalitami naznačujícími vrozenou CMV infekci (jak je uvedeno v Hui L a Wood G. Perinatální výsledek po mateřské primární cytomegalovirové infekci v prvním trimestru: praktická aktualizace a poradenská pomůcka. 2015 Prenatální diagnostika; 35:1-7. ) Nárok bude mít každá anglicky mluvící žena ve věku 18 nebo více let, která je schopna dát informovaný souhlas.

Skupinu případů budou tvořit subjekty s potvrzenou fetální CMV infekcí. Kontrolní skupinu budou tvořit plody bez známek vrozené infekce. Strukturálně abnormální plody, které jsou CMV negativní, budou z analýzy kontrolní skupiny vyloučeny. Míra infikovaných vs. neinfikovaných plodů po infekci matky je přibližně 40 %, takže předpokládáme rozumný poměr případů a kontrol pro naši cílovou velikost vzorku.

První kontakt naváže klinický tým, ale bude následovat výzkumná porodní asistentka, která podrobně prodiskutuje výzkumnou studii, a to buď telefonicky, nebo tváří v tvář po klinické konzultaci, kdykoli to bude možné. Je to proto, aby se minimalizovaly potenciální konflikty vyplývající z toho, že lékaři získají souhlas pacienta se studií. Pacienti budou ujištěni, že nebudou povinni se zúčastnit a že jejich rozhodnutí neovlivní jejich klinickou péči nebo vztah s jejich ošetřujícím lékařem. kabinetu na příslušných odděleních perinatální medicíny.

Kritéria vyloučení Ženy, které nedávají souhlas, nejsou schopny souhlasit s lékařskými zákroky, nemluví anglicky nebo jsou mladší 18 let.

Statistické analýzy Velikost vzorku Obecně platí, že čím více biologických replikátů (větší velikost vzorku), tím silnější jsou závěry, které lze provést z dat genové exprese. Biologické variace mezi vzorky a očekávané rozšíření rozdílné genové exprese jsou důležité faktory ovlivňující ideální velikost vzorku. Pro tuto studii vědci předem nevědí, jak by byly distribuovány úrovně genové exprese, což omezuje naši schopnost používat algoritmy velikosti vzorku pro experimenty RNA-seq. Kromě omezení dostupnosti vzorků diskutovaných výše, vysoké náklady spojené s laboratorním zpracováním omezovaly proveditelnost použití velkého počtu vzorků AF.

Hlavní faktory, které ovlivňují formální výpočty velikosti vzorku pro experimenty se sekvenováním RNA, jsou: hloubka sekvenování, variační koeficient, velikost detekované diferenciální exprese, míra falešné pozitivity a síla. Za předpokladu průměrné hloubky čtení 20, shodné v rámci skupinového variačního koeficientu 0,4, velikosti účinku 2x, 0,05 falešně pozitivního výskytu a 80% síly, je požadovaný počet subjektů na skupinu 7,1 Vyšetřovatelé se proto zaměřují na minimální cíl deset vzorků na skupinu.

Analýza diferenciální genové exprese a funkční analýza Pro statistickou a analytickou podporu pro data genové exprese bude k dispozici konzultant bioinformatiky v rámci Translační porodnické skupiny. Budou identifikovány geny, které jsou významně dysregulovány v případech infikovaných CMV ve srovnání s neinfikovanými kontrolami. Funkční analýzy odlišně exprimovaných genů budou provedeny pomocí softwaru Ingenuity Pathways Analysis (IPA) verze 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity je ručně spravovaná databáze, která identifikuje nadměrně zastoupené biologické procesy v daném souboru dat a vypočítává skóre významnosti pro každý výsledek pomocí pravostranného Fisherova testu. Vyšetřovatelé také použijí veřejně dostupnou funkční anotaci specifickou pro plod „Developmental FunctionaL Annotation at Tufts“ (DFLAT), u níž bylo dříve prokázáno, že zlepšuje biologickou interpretaci souborů perinatálních dat (http://dflat.cs.tufts.edu).2