Développement de biomarqueurs potentiels pour le développement du cerveau fœtal après une infection congénitale à CMV

Justification de l'étude Les outils actuels de prédiction de l'issue périnatale après une infection fœtale par le CMV sont très limités. L'amniocentèse est généralement proposée à partir de 20 semaines de gestation pour diagnostiquer une infection fœtale. Cet échantillonnage offre l'occasion d'étudier de nouvelles approches pour prédire l'issue périnatale.

Cette étude vise à développer une approche basée sur l'ARNm pour étudier l'impact du CMV sur le fœtus en développement. La thèse de doctorat du Dr Hui était basée sur l'étude de l'ARNm du liquide amniotique en tant que "fluide sommaire" d'expression génique du fœtus qui fournit des informations significatives sur le développement. Ces travaux suggèrent que des informations sur le développement neurologique fœtal peuvent être obtenues à partir du liquide amniotique via des transcrits spécifiques du cerveau fœtal (ARNm) acellulaires.

Si une femme à risque de CMV congénital choisit d'avoir une amniocentèse pour le diagnostic d'infection fœtale, cet échantillonnage offre l'occasion de prélever une aliquote de FA pour l'analyse de l'ARN. Le séquençage d'ARN (RNAseq) est une technologie relativement nouvelle qui permet une analyse détaillée des gènes qui sont activement exprimés (« activés ») au cours d'un état pathologique particulier. Les chercheurs appliqueront des méthodes de séquençage d'ARN au liquide amniotique pour rechercher des différences potentielles d'expression génique qui pourraient aider à comprendre la maladie grâce à une analyse fonctionnelle et à l'identification de biomarqueurs candidats pour de futures études.

Hypothèse Que les fœtus infectés par le CMV auront un profil d'expression génique altéré par rapport aux fœtus non infectés, comme cela a été constaté dans l'ARN acellulaire du liquide amniotique.

Objectifs Effectuer une analyse comparative du transcriptome entier de l'ARN AF de fœtus infectés et non infectés par le CMV à l'aide de la technologie de séquençage de l'ARN.

Méthodes Il s'agira d'une étude multicentrique impliquant des unités de médecine fœtale à Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) et Louvain (UZ Leuven, Louvain). Les investigateurs visent à recruter 20 femmes (10 cas, 10 témoins) sur 2 ans.

Des échantillons seront prélevés lors d'une amniocentèse cliniquement indiquée réalisée dans le but de diagnostiquer la présence ou l'absence d'infection congénitale. Ceci est généralement effectué à 20-21 semaines de gestation pour les femmes présentant une séroconversion en début de grossesse, ou au moment de l'évaluation fœtale en cas d'aiguillage avec des anomalies structurelles. Un volume de liquide amniotique (FA) de 5 à 10 ml serait nécessaire pour l'étude de recherche. Ce volume d'échantillon ne représente pas une charge importante pour le clinicien effectuant la procédure (seulement 10 à 20 secondes de temps de collecte supplémentaire) et n'augmente pas le risque de la procédure pour la grossesse ou la femme car il n'y a PAS d'insertion d'aiguille supplémentaire (pas d'augmentation de fausse couche ou impact sur le bien-être fœtal ou maternel).

L'échantillon de recherche sera stocké dans un flacon séparé de l'échantillon clinique sur les sites de recrutement respectifs. Il est stocké à 4 degrés Celsius puis centrifugé à 300 x g pendant 10 minutes dans les 6 heures suivant le prélèvement. Le surnageant AF sera retiré et stocké dans un tube séparé. La partie cellulaire et le surnageant seront congelés et conservés à - 80°C. Le site de recrutement de Sydney transportera les échantillons au laboratoire de l'Université de Melbourne au Mercy Hospital for Women sur de la neige carbonique, où ils seront traités. Tous les échantillons recevront un numéro d'identification d'échantillon d'étude avant d'être transportés au laboratoire de recherche de l'Université de Melbourne au Mercy Hospital for Women afin de protéger la confidentialité des participants.

L'ARN total d'échantillons de FA provenant de 10 fœtus infectés par le CMV et de 10 fœtus non infectés, appariés pour l'âge gestationnel et le sexe fœtal, sera analysé. L'ARN total sera extrait des échantillons de surnageant AF à l'aide du kit d'extraction d'acide nucléique circulant Qiagen. L'amplification du transcriptome entier et le séquençage de l'ARN de l'ARN sans cellule seront effectués et les profils d'expression des groupes de cas et de contrôle seront comparés dans une analyse appariée, comme dans les études précédentes sur l'ARN AF. L'analyse des voies des gènes à régulation différentielle sera utilisée pour l'interprétation biologique. Les chercheurs utiliseront à la fois un logiciel commercial largement utilisé (Ingenuity Pathway Analysis™) et un outil d'analyse fonctionnelle spécifique au fœtus développé par des collaborateurs de l'Université Tufts (DFLAT).

Les transcrits cérébraux les plus régulés à la baisse et à la hausse seront identifiés comme des biomarqueurs candidats de résultats anormaux pour de futures études de validation.

Les résultats de la grossesse jusqu'à six semaines après l'accouchement pour la mère et le bébé seront recueillis à partir du dossier médical de l'hôpital, y compris les anomalies fœtales détectées à l'échographie ou à l'IRM, la gestation et le mode d'accouchement, le poids à la naissance, l'utilisation de thérapies prénatales (immunoglobuline CMV ou autre), les investigations néonatales tels que les résultats des analyses d'urine/salive/sang de cordon, l'échographie crânienne, l'examen physique et les résultats du dépistage auditif chez le nouveau-né.

Résultats attendus : par rapport aux fœtus non infectés, les fœtus infectés par le CMV présenteront des voies de développement neurologique et une expression génique altérées lors de l'analyse fonctionnelle. Les transcrits spécifiques au cerveau fœtal qui sont exprimés de manière différentielle chez les fœtus infectés par le CMV seront identifiés comme biomarqueurs candidats des résultats neurodéveloppementaux pour les futures études de validation.

Stockage et sécurité des données La base de données sera configurée dans RedCap (Research Electronic Data Capture), une application Web gratuite et sécurisée conçue pour prendre en charge la saisie des données des patients pour les études de recherche. Le service REDCap de l'Université de Melbourne fournit des politiques de stockage et de sauvegarde sécurisées conformes aux normes de l'Université et à la loi américaine sur les informations sur la santé et la confidentialité. Seuls les investigateurs de l'étude auront accès à cette base de données.

Des copies papier des formulaires de consentement et d'autres informations sur l'étude seront conservées dans des classeurs verrouillés. Seuls les investigateurs de l'étude et le HREC auront accès aux dossiers.

6.0 Critères d'inclusion Les femmes subissant une amniocentèse cliniquement indiquée pour suspicion d'infection congénitale à CMV par le biais du Département de médecine périnatale du Mercy Hospital for Women ou du Royal Hospital for Women, Randwick seront identifiées à partir des références de la clinique périnatale par le Dr Hui ou le Dr Shand respectivement. Ces femmes comprendront (i) des femmes présentant des signes d'infection maternelle primaire à CMV pendant la grossesse (ii) des fœtus présentant des anomalies structurelles suggérant une infection congénitale à CMV (comme indiqué dans Hui L et Wood G. Résultats périnatals après une infection maternelle primaire à cytomégalovirus au cours du premier trimestre : une mise à jour pratique et une aide-conseil. Diagnostic Prénatal 2015 ; 35:1-7. ) Toute femme anglophone âgée de 18 ans ou plus et capable de donner un consentement éclairé sera éligible.

Les sujets avec une infection fœtale à CMV confirmée formeront le groupe de cas. Les fœtus sans signe d'infection congénitale formeront le groupe témoin. Les fœtus structurellement anormaux qui sont négatifs pour le CMV seront exclus de l'analyse du groupe témoin. Le taux de fœtus infectés vs non infectés suite à une infection maternelle est d'environ 40 %, nous prévoyons donc un ratio raisonnable de cas et de témoins pour la taille de notre échantillon cible.

Le contact initial sera établi par l'équipe clinique, mais un suivi par une sage-femme de recherche pour discuter en détail de l'étude de recherche sera effectué, soit par téléphone, soit en face à face après la consultation clinique dans la mesure du possible. Ceci afin de minimiser les conflits potentiels liés au fait que les cliniciens obtiennent le consentement du patient pour l'étude. Les patientes seront rassurées sur le fait qu'elles n'auront aucune obligation de participer et que leur décision n'affectera pas leurs soins cliniques ou leur relation avec leur médecin traitant. Un consentement écrit et éclairé sera obtenu des femmes avant leur procédure et sera conservé dans un dossier verrouillé. cabinet dans les départements respectifs de médecine périnatale.

Critères d'exclusion Les femmes qui ne donnent pas leur consentement, qui ne sont pas capables de consentir à des actes médicaux, qui ne parlent pas anglais ou qui ont moins de 18 ans.

Analyses statistiques Taille de l'échantillon En général, plus il y a de répliques biologiques (taille d'échantillon plus grande), plus les inférences qui peuvent être faites à partir des données d'expression génique sont fortes. La variation biologique entre les échantillons et la propagation attendue de l'expression différentielle des gènes sont des facteurs importants qui influent sur la taille idéale de l'échantillon. Pour cette étude, les chercheurs ne savent pas à l'avance comment les niveaux d'expression génique seraient distribués, limitant ainsi notre capacité à utiliser des algorithmes de taille d'échantillon pour les expériences RNA-seq. En plus des restrictions sur la disponibilité des échantillons discutées ci-dessus, les coûts élevés associés au traitement en laboratoire ont limité la possibilité d'utiliser un grand nombre d'échantillons AF.

Les principaux facteurs qui influencent les calculs formels de taille d'échantillon pour les expériences de séquençage d'ARN sont : la profondeur de séquençage, le coefficient de variation, l'ampleur de l'expression différentielle détectée, le taux de faux positifs et la puissance. En supposant une profondeur de lecture moyenne de 20, un coefficient de variation égal au sein du groupe de 0,4, une taille d'effet de 2 fois, un taux de faux positifs de 0,05 et une puissance de 80 %, le nombre de sujets par groupe requis est de 7,1. Les enquêteurs visent donc un objectif minimum de dix échantillons par groupe.

Analyse de l'expression différentielle des gènes et analyse fonctionnelle Un consultant spécialiste en bioinformatique au sein du groupe d'obstétrique translationnel sera disponible pour un soutien statistique et d'analyse des données d'expression des gènes. Les gènes significativement dérégulés chez les cas infectés par le CMV par rapport aux témoins non infectés seront identifiés. Des analyses fonctionnelles des gènes exprimés de manière différentielle seront effectuées à l'aide du logiciel Ingenuity Pathways Analysis (IPA) Version 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity est une base de données organisée manuellement qui identifie les processus biologiques surreprésentés dans un ensemble de données donné et calcule un score de signification pour chaque résultat à l'aide du test de Fisher à queue droite. Les chercheurs utiliseront également une annotation fonctionnelle spécifique au fœtus accessible au public "Developmental FunctionaL Annotation at Tufts" (DFLAT) dont il a déjà été démontré qu'elle améliore l'interprétation biologique des ensembles de données périnatales (http://dflat.cs.tufts.edu).2