Mahdollisten biomarkkerien kehittäminen sikiön aivojen kehitykselle synnynnäisen CMV-infektion jälkeen

Tutkimuksen perusteet Nykyiset työkalut perinataalisen lopputuloksen ennustamiseen sikiön CMV-infektion jälkeen ovat hyvin rajallisia. Lapsivesitutkimusta tarjotaan yleensä 20 raskausviikolla sikiön infektion diagnosoimiseksi. Tämä näytteenotto tarjoaa mahdollisuuden tutkia uusia lähestymistapoja perinataalisen lopputuloksen ennustamiseen.

Tämän tutkimuksen tavoitteena on kehittää mRNA-pohjainen lähestymistapa CMV:n vaikutuksen tutkimiseen kehittyvään sikiöön. Tohtori Huin väitöskirja perustui lapsivesien mRNA:n tutkimukseen sikiön geeniekspression "yhteenvetonesteenä", joka tarjoaa merkityksellistä tietoa kehityksestä. Tämä työ ehdotti, että tietoa sikiön hermoston kehityksestä on saatavissa lapsivedestä soluttomien sikiön aivospesifisten transkriptien (mRNA:iden) kautta.

Jos nainen, jolla on synnynnäisen CMV:n riski, valitsee lapsivesitutkimuksen sikiöinfektion diagnosoimiseksi, tämä näytteenotto tarjoaa mahdollisuuden kerätä AF:n alikvootti RNA-analyysiä varten. RNA-sekvensointi (RNAseq) on suhteellisen uusi tekniikka, joka mahdollistaa tietyn sairaustilan aikana aktiivisesti ilmentyvien ("päällekytkettyjen") geenien yksityiskohtaisen analyysin. Tutkijat soveltavat RNA-sekvensointimenetelmiä lapsiveteen etsiäkseen mahdollisia geenien ilmentymisen eroja, jotka voivat auttaa ymmärtämään tautia toiminnallisen analyysin avulla ja tunnistamaan ehdokasbiomarkkereita tulevia tutkimuksia varten.

Hypoteesi, että CMV-tartunnan saaneilla sikiöillä on muuttunut geeniekspressioprofiili verrattuna ei-infektoituneisiin sikiöihin, kuten lapsiveden soluvapaassa RNA:ssa on todettu.

Tavoitteet Suorittaa CMV-infektoituneiden ja infektoimattomien sikiöiden AF-RNA:n vertaileva kokonaistranskriptomianalyysi käyttämällä RNA-sekvensointitekniikkaa.

Menetelmät Tämä on monikeskustutkimus, johon osallistuu sikiölääkeyksiköitä Melbournessa (Mercy Hospital for Women), Sydneyssä (Royal Hospital for Women, Randwick) ja Leuvenissa (UZ Leuven, Leuven). Tutkijoiden tavoitteena on värvätä 20 naista (10 tapausta, 10 kontrollia) kahden vuoden aikana.

Näytteitä kerätään kliinisesti indikoidun lapsivesitutkimuksen aikana, jotta voidaan diagnosoida synnynnäisen infektion olemassaolo tai puuttuminen. Tämä tehdään yleensä 20–21 raskausviikolla naisille, joilla on serokonversio raskauden alkuvaiheessa, tai sikiön arvioinnin yhteydessä, jos lähetteiden yhteydessä on rakenteellisia poikkeavuuksia. Tutkimukseen tarvittaisiin 5-10 ml lapsivettä (AF). Tämä näytemäärä ei aiheuta merkittävää taakkaa toimenpiteen suorittavalle kliinikolle (vain 10-20 sekuntia lisäkeräysaikaa) eikä lisää toimenpiteen riskiä raskaana oleville tai naiselle, koska EI ole asetettu ylimääräistä neulaa (ei lisäneulaa). keskenmeno tai vaikutus sikiön tai äidin hyvinvointiin).

Tutkimusnäyte säilytetään erillisessä pullossa kliinisen näytteen kanssa vastaavissa rekrytointipisteissä. Sitä säilytetään 4 celsiusasteessa ja sentrifugoidaan sitten 300 x g:ssä 10 minuuttia 6 tunnin sisällä keräämisestä. AF-supernatantti otetaan pois ja varastoidaan erilliseen putkeen. Sekä soluosa että supernatantti pakastetaan ja säilytetään -80 °C:ssa. Sydneyn rekrytointipaikka kuljettaa näytteet Melbournen yliopiston laboratorioon Mercy Hospital for Womenin kuivajäällä, jossa ne käsitellään. Kaikille näytteille annetaan tutkimusnäytteen tunnusnumero ennen niiden kuljettamista Mercy Hospital for Womenin Melbournen yliopiston tutkimuslaboratorioon osallistujien yksityisyyden suojaamiseksi.

10 CMV-tartunnan saaneen ja 10 infektoimattoman sikiön AF-näytteistä saatu kokonais-RNA analysoidaan gestaatioiän ja sikiön sukupuolen mukaan. Kokonais-RNA uutetaan AF-supernatanttinäytteistä käyttäen Qiagen Circulating Nucleic Acid -uuttosarjaa. Soluvapaan RNA:n koko transkriptioamplifikaatio ja RNA-sekvensointi suoritetaan ja tapaus- ja kontrolliryhmien ilmentymisprofiileja verrataan parianalyysissä, kuten suoritettiin aiemmissa AF-RNA:n tutkimuksissa. Biologisessa tulkinnassa käytetään differentiaalisesti säädeltyjen geenien polkuanalyysiä. Tutkijat käyttävät sekä laajalti käytettyä kaupallista ohjelmistoa (Ingenuity Pathway Analysis™) että sikiökohtaista toiminnallista analyysityökalua, jonka ovat kehittäneet Tufts Universityn (DFLAT) yhteistyökumppanit.

Eniten alas- ja ylöspäin säädellyt aivotranskriptit tunnistetaan epänormaalin tuloksen ehdokasbiomarkkereiksi tulevia validointitutkimuksia varten.

Äidin ja vauvan raskaustulokset kuuden viikon synnytyksen jälkeen kerätään sairaalan sairauskertomuksesta, mukaan lukien ultraäänellä tai magneettikuvauksella havaitut sikiön poikkeavuudet, raskaus ja syntymätapa, syntymäpaino, synnytystä edeltävien hoitojen käyttö (CMV-immunoglobuliini tai muu), vastasyntyneiden tutkimukset kuten virtsan/syljen/napanuoraveren testitulokset, kallon ultraääni, fyysinen tutkimus ja vastasyntyneen kuuloseulonnan tulokset.

Odotetut tulokset: Verrattuna ei-infektoituneisiin sikiöihin, CMV-tartunnan saaneiden sikiöiden hermoston kehitysreitit ja geeniekspressio ovat muuttuneet toiminnallisessa analyysissä. Sikiön aivospesifiset transkriptit, jotka ilmentyvät eri tavalla CMV-infektoituneissa sikiöissä, tunnistetaan hermoston kehitystuloksen ehdokasbiomarkkereiksi tulevia validointitutkimuksia varten.

Tietojen tallennus ja turvallisuus Tietokanta perustetaan RedCapissa (Research Electronic Data Capture), joka on ilmainen, turvallinen verkkopohjainen sovellus, joka on suunniteltu tukemaan potilastietojen keräämistä tutkimustutkimuksia varten. Melbournen yliopiston REDCap-palvelu tarjoaa turvalliset tallennus- ja varmuuskopiointikäytännöt, jotka ovat yliopiston standardien ja Yhdysvaltojen terveystieto- ja tietosuojalain mukaisia. Vain tutkimuksen tutkijoilla on pääsy tähän tietokantaan.

Suostumuslomakkeiden paperikopiot ja muut tutkimustiedot säilytetään lukituissa arkistokaapeissa. Vain tutkimuksen tutkijoilla ja HREC:llä on pääsy tiedostoihin.

6.0 Sisällytämiskriteerit Naiset, joille tehdään kliinisesti indikoitu lapsivesitutkimus epäillyn synnynnäisen CMV-infektion vuoksi Mercy Hospital for Womenin tai Royal Hospital for Women Randwickin perinataalilääketieteen osastolla, tohtori Hui tai tohtori Shand tunnistaa perinataaliklinikan lähetteiden perusteella. Näihin naisiin kuuluvat (i) naiset, joilla on merkkejä äidin primaarisesta CMV-infektiosta raskauden aikana (ii) sikiöt, joilla on rakenteellisia poikkeavuuksia, jotka viittaavat synnynnäiseen CMV-infektioon (lueteltu Hui L:ssä ja Wood G:ssä. Perinataalinen lopputulos äidin primaarisen sytomegalovirusinfektion jälkeen ensimmäisen raskauskolmanneksen aikana: käytännöllinen päivitys ja neuvonta-apu. 2015 Prenataalinen diagnoosi; 35:1-7. ) Kaikki 18-vuotiaat tai sitä vanhemmat englantia puhuvat naiset, jotka pystyvät antamaan tietoisen suostumuksen, ovat kelvollisia.

Koehenkilöt, joilla on vahvistettu sikiön CMV-infektio, muodostavat tapausryhmän. Sikiöt, joilla ei ole todisteita synnynnäisestä infektiosta, muodostavat kontrolliryhmän. Rakenteellisesti epänormaalit sikiöt, jotka ovat CMV-negatiivisia, suljetaan pois kontrolliryhmän analyysistä. Infektoituneiden vs. ei-tartunnan saaneiden sikiöiden osuus äidin infektion jälkeen on noin 40 %, joten odotamme kohtuullisen tapausten ja kontrollien suhteen tavoiteotoskokoamme.

Ensimmäisen yhteydenoton ottaa kliininen ryhmä, mutta tutkimuskätilön seuranta keskustellakseen tutkimustutkimuksesta yksityiskohtaisesti joko puhelimitse tai kasvokkain kliinisen konsultaation jälkeen aina kun mahdollista. Tällä pyritään minimoimaan mahdolliset ristiriidat, jotka johtuvat siitä, että lääkärit saavat potilaan suostumuksen tutkimukseen. Potilaat vakuutetaan, että heillä ei ole velvollisuutta osallistua ja että heidän päätöksensä ei vaikuta heidän kliiniseen hoitoon tai suhteeseensa hoitavaan lääkäriin. Naisilta hankitaan kirjallinen, tietoinen suostumus ennen toimenpidettä ja säilytetään lukitussa arkistossa. kaappi vastaavilla perinataalilääketieteen osastoilla.

Poissulkemiskriteerit Naiset, jotka eivät anna suostumusta, jotka eivät pysty antamaan suostumusta lääketieteellisiin toimenpiteisiin, eivät puhu englantia tai ovat alle 18-vuotiaita.

Tilastolliset analyysit Näytteen koko Yleisesti ottaen mitä enemmän biologisia replikaatioita (suurempi näytekoko), sitä vahvempia päätelmiä voidaan tehdä geenin ilmentymisdatasta. Näytteiden välinen biologinen vaihtelu ja differentiaalisen geeniekspression odotettu leviäminen ovat tärkeitä tekijöitä, jotka vaikuttavat ihanteelliseen näytekokoon. Tätä tutkimusta varten tutkijat eivät tiedä etukäteen, kuinka geenien ilmentymistasot jakautuisivat, mikä rajoittaa kykyämme käyttää näytekokoalgoritmeja RNA-seq-kokeissa. Edellä käsiteltyjen näytteiden saatavuutta koskevien rajoitusten lisäksi laboratoriokäsittelyyn liittyvät korkeat kustannukset rajoittivat mahdollisuutta käyttää suuria määriä AF-näytteitä.

Tärkeimmät tekijät, jotka vaikuttavat RNA-sekvensointikokeiden muodollisiin näytekoon laskelmiin, ovat: sekvensoinnin syvyys, variaatiokerroin, havaitun differentiaalisen ilmentymisen suuruus, väärä positiivinen nopeus ja teho. Olettaen, että keskimääräinen lukusyvyys on 20, sama kuin ryhmän variaatiokerroin 0,4, vaikutuskoko 2-kertainen, 0,05 väärän positiivinen määrä ja 80 %:n teho, vaadittava koehenkilömäärä ryhmää kohti on 7,1. Siksi tutkijat pyrkivät saavuttamaan vähimmäistavoitteen kymmenen näytettä ryhmää kohden.

Differentiaalisen geeniekspression analyysi ja toiminnallinen analyysi Translational Obstetric Groupin bioinformatiikan konsulttiasiantuntija on käytettävissä geeniekspressiotietojen tilasto- ja analyysitukea varten. Geenit, jotka ovat merkittävästi epäsäänneltyjä CMV-tartunnan saaneissa tapauksissa verrattuna ei-infektoituneisiin kontrolleihin, tunnistetaan. Erilaisesti ilmentyneiden geenien toiminnalliset analyysit suoritetaan käyttämällä Ingenuity Pathways Analysis (IPA) -ohjelmistoa versio 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity on manuaalisesti kuratoitu tietokanta, joka tunnistaa yliedustetut biologiset prosessit tietyssä tietojoukossa ja laskee kullekin tulokselle merkitsevyyspisteet käyttämällä oikeansuuntaista Fisherin testiä. Tutkijat käyttävät myös julkisesti saatavilla olevaa sikiökohtaista toiminnallista merkintää "Developmental FunctionaL Annotation at Tufts" (DFLAT), jonka on aiemmin osoitettu parantavan perinataalisten aineistojen biologista tulkintaa (http://dflat.cs.tufts.edu).2