Utvikling av potensielle biomarkører for føtal hjerneutvikling etter medfødt CMV-infeksjon

Begrunnelse for studien Dagens verktøy for prediksjon av perinatalt utfall etter fosterinfeksjon med CMV er svært begrenset. Fostervannsprøve tilbys vanligvis fra 20 ukers svangerskap for å diagnostisere fosterinfeksjon. Denne prøven gir en mulighet til å undersøke nye tilnærminger for å forutsi perinatalt utfall.

Denne studien tar sikte på å utvikle en mRNA-basert tilnærming for å studere virkningen av CMV på det utviklende fosteret. Dr Huis doktorgradsavhandling var basert på studiet av fostervanns-mRNA som et genuttrykk "oppsummeringsvæske" av fosteret som gir meningsfull informasjon om utvikling. Dette arbeidet antydet at informasjon om føtal nevroutvikling er tilgjengelig fra fostervann via cellefrie føtale hjernespesifikke transkripsjoner (mRNA).

Dersom en kvinne med risiko for medfødt CMV velger å ta en fostervannsprøve for diagnostisering av fosterinfeksjon, gir denne prøvetakingen en mulighet til å samle en aliquot av AF for RNA-analyse. RNA-sekvensering (RNAseq) er en relativt ny teknologi som muliggjør detaljert analyse av genene som aktivt uttrykkes («slått på») under en bestemt sykdomstilstand. Etterforskerne vil bruke RNA-sekvenseringsmetoder på fostervann for å søke etter potensielle genekspresjonsforskjeller som kan hjelpe til med å forstå sykdommen gjennom funksjonell analyse og identifisere kandidatbiomarkører for fremtidige studier.

Hypotese om at foster infisert med CMV vil ha en endret genekspresjonsprofil sammenlignet med ikke-infiserte fostre, slik det er konstatert i fostervannscellefritt RNA.

Mål Å utføre sammenlignende heltranskriptomanalyse av AF RNA fra CMV-infiserte og uinfiserte fostre ved bruk av RNA-sekvenseringsteknologi.

Metoder Dette vil være en multisenterstudie som involverer føtalmedisinske enheter i Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) og Leuven (UZ Leuven, Leuven). Etterforskerne tar sikte på å rekruttere 20 kvinner (10 saker, 10 kontroller) over 2 år.

Prøver vil bli samlet inn under klinisk indisert fostervannsprøve utført med det formål å diagnostisere tilstedeværelse eller fravær av medfødt infeksjon. Dette utføres vanligvis ved 20-21 svangerskapsuke for kvinner med serokonversjon tidlig i svangerskapet, eller ved fostervurdering ved henvisninger med strukturelle avvik. Et fostervannsvolum (AF) på 5-10 ml vil være nødvendig for forskningsstudien. Dette prøvevolumet utgjør ikke en betydelig belastning for klinikeren som utfører prosedyren (bare 10-20 sekunder ekstra innsamlingstid) og øker ikke risikoen for prosedyren for svangerskapet eller kvinnen da det IKKE er noen ekstra kanyleinnføring (ingen økning i spontanabort eller innvirkning på fosterets eller mors velvære).

Forskningsprøven vil bli lagret i et eget hetteglass til den kliniske prøven på de respektive rekrutteringsstedene. Den lagres ved 4 grader Celsius og sentrifugeres deretter ved 300 x g i 10 minutter innen 6 timer etter innsamling. AF-supernatanten tas av og lagres i et separat rør. Både den cellulære delen og supernatanten vil bli frosset og lagret ved -80°C. Rekrutteringsstedet i Sydney vil frakte prøvene til University of Melbourne-laboratoriet ved Mercy Hospital for Women på tørris, hvor de vil bli behandlet. Alle prøver vil bli gitt et studieprøve-ID-nummer før transport til University of Melbourne forskningslaboratorium ved Mercy Hospital for Women for å beskytte deltakernes personvern.

Totalt RNA fra AF-prøver fra 10 CMV-infiserte og 10 uinfiserte fostre, matchet for svangerskapsalder og fosterkjønn, vil bli analysert. Totalt RNA vil bli ekstrahert fra AF-supernatantprøvene vil bli utført ved å bruke Qiagen Circulating Nucleic Acid-ekstraksjonssettet. Hele transkriptomamplifikasjon og RNA-sekvensering av cellefri RNA vil bli utført og ekspresjonsprofilene til case- og kontrollgruppene sammenlignes i en paret analyse som utført i tidligere studier av AF RNA. Baneanalyse av de differensielt regulerte genene vil bli brukt for den biologiske tolkningen. Etterforskerne vil bruke både mye brukt kommersiell programvare (Ingenuity Pathway Analysis™) og et fosterspesifikt funksjonelt analyseverktøy utviklet av samarbeidspartnere ved Tufts University (DFLAT).

De mest ned- og oppregulerte hjernetranskripsjonene vil bli identifisert som kandidatbiomarkører for unormalt utfall for fremtidige valideringsstudier.

Graviditetsutfall til seks uker etter fødsel for mor og baby vil bli samlet inn fra sykehusets journal, inkludert fosteravvik påvist på ultralyd eller MR, svangerskap og fødselsmåte, fødselsvekt, bruk av prenatal terapi (CMV-immunoglobulin eller annet), nyfødtundersøkelser som urin/spytt/navlestrengsblodprøveresultater, kranial ultralyd, fysisk undersøkelse og resultater av hørselsscreening for nyfødte.

Forventede utfall: Sammenlignet med uinfiserte fostre, vil CMV-infiserte fostre vise endrede nevroutviklingsveier og genuttrykk ved funksjonell analyse. Foster-hjernespesifikke transkripsjoner som er differensielt uttrykt i CMV-infiserte fostre vil bli identifisert som kandidatbiomarkører for nevroutviklingsresultat for fremtidige valideringsstudier.

Datalagring og sikkerhet Databasen vil bli satt opp i RedCap (Research Electronic Data Capture), en gratis, sikker, nettbasert applikasjon utviklet for å støtte innhenting av pasientdata for forskningsstudier. University of Melbourne REDCap-tjenesten gir sikker lagring og sikkerhetskopiering som er i samsvar med universitetets standarder og USAs helseinformasjons- og personvernlov. Bare studieforskerne vil ha tilgang til denne databasen.

Papirkopier av samtykkeskjemaer og annen studieinformasjon vil oppbevares i låste arkivskap. Bare studieetterforskerne og HREC vil ha tilgang til filene.

6.0 Inklusjonskriterier Kvinner som gjennomgår klinisk indisert fostervannsprøve for mistanke om medfødt CMV-infeksjon gjennom avdelingen for perinatal medisin ved Mercy Hospital for Women eller Royal Hospital for Women, Randwick vil bli identifisert fra henvisningene til perinatalklinikken av henholdsvis Dr Hui eller Dr Shand. Disse kvinnene vil inkludere (i) kvinner med tegn på mors primær CMV-infeksjon under graviditet (ii) fostre med strukturelle abnormiteter som tyder på medfødt CMV-infeksjon (som oppført i Hui L og Wood G. Perinatalt utfall etter mors primære cytomegalovirusinfeksjon i første trimester: en praktisk oppdatering og rådgivningshjelp. 2015 Prenatal diagnose; 35:1-7. ) Enhver engelsktalende kvinne på 18 år eller eldre som er i stand til å gi informert samtykke vil være kvalifisert.

Pasienter med bekreftet føtal CMV-infeksjon vil utgjøre casegruppen. Fostre uten tegn på medfødt infeksjon vil utgjøre kontrollgruppen. Strukturelt unormale fostre som er CMV-negative vil bli ekskludert fra kontrollgruppeanalysen. Frekvensen av infiserte kontra ikke-infiserte fostre etter mors infeksjon er omtrent 40 %, så vi forventer et rimelig forhold mellom tilfeller og kontroller for vår målprøvestørrelse.

Innledende kontakt vil bli tatt av det kliniske teamet, men oppfølging av en forskningsjordmor for å diskutere forskningsstudien i detalj vil bli tatt, enten via telefon eller ansikt til ansikt etter den kliniske konsultasjonen der det er mulig. Dette er for å minimere potensielle konflikter ved at klinikerne får pasientens samtykke til studien. Pasienter vil bli forsikret om at de ikke er forpliktet til å delta og at deres avgjørelse ikke vil påvirke deres kliniske behandling eller forhold til deres behandlende lege. Skriftlig informert samtykke vil bli innhentet fra kvinner før prosedyren og lagres i en låst arkiv. kabinett i de respektive avdelinger for perinatal medisin.

Eksklusjonskriterier Kvinner som ikke gir samtykke, som ikke er i stand til å samtykke til medisinske prosedyrer, ikke-engelsktalende, eller som er under 18 år.

Statistiske analyser Prøvestørrelse Generelt, jo flere biologiske replikater (større prøvestørrelse), jo sterkere slutninger kan man trekke fra genuttrykksdataene. Biologisk variasjon mellom prøver og forventet spredning av differensielt genuttrykk er viktige faktorer som påvirker den ideelle prøvestørrelsen. For denne studien vet ikke etterforskerne på forhånd hvordan genuttrykksnivåene vil bli fordelt, og begrenser dermed vår evne til å bruke prøvestørrelsesalgoritmer for RNA-seq-eksperimenter. I tillegg til restriksjonene på prøvetilgjengelighet diskutert ovenfor, begrenset de høye kostnadene forbundet med laboratoriebehandling muligheten for å bruke et stort antall AF-prøver.

Hovedfaktorene som påvirker formelle prøvestørrelsesberegninger for RNA-sekvenseringseksperimenter er: sekvenseringsdybde, variasjonskoeffisient, størrelsen på differensielt uttrykk påvist, falsk positiv rate og kraft. Forutsatt en gjennomsnittlig lesedybde på 20, lik innenfor gruppevariasjonskoeffisient på 0,4, en effektstørrelse på 2 ganger, 0,05 falsk positiv rate og 80 % kraft, er antallet forsøkspersoner per gruppe som kreves 7,1. Etterforskerne sikter derfor mot et minimumsmål på ti prøver per gruppe.

Analyse av differensielt genuttrykk og funksjonsanalyse En konsulent bioinformatikkspesialist innen Translational Obstetric Group vil være tilgjengelig for statistisk og analysestøtte for genuttrykksdataene. Gener som er betydelig dysregulert i CMV-infiserte tilfeller sammenlignet med ikke-infiserte kontroller vil bli identifisert. Funksjonelle analyser av de differensielt uttrykte genene vil bli utført ved hjelp av Ingenuity Pathways Analysis (IPA) versjon 9.0 programvare (Ingenuity; Redwood City, CA). Oppfinnsomhet er en manuelt kurert database som identifiserer overrepresenterte biologiske prosesser i et gitt datasett og beregner en signifikansskåre for hvert resultat ved å bruke den høyrehalede Fishers test. Etterforskerne vil også bruke en offentlig tilgjengelig fosterspesifikk funksjonell merknad "Developmental Functional Annotation at Tufts" (DFLAT) som tidligere har vist seg å forbedre biologisk tolkning av perinatale datasett (http://dflat.cs.tufts.edu).2