Sviluppo di potenziali biomarcatori per lo sviluppo del cervello fetale dopo infezione congenita da CMV

Motivazione dello studio Gli attuali strumenti per la previsione dell'esito perinatale dopo l'infezione fetale da CMV sono molto limitati. L'amniocentesi viene solitamente offerta dalla 20a settimana di gestazione per diagnosticare l'infezione fetale. Questo campionamento offre l'opportunità di studiare nuovi approcci per prevedere l'esito perinatale.

Questo studio mira a sviluppare un approccio basato sull'mRNA per studiare l'impatto del CMV sullo sviluppo del feto. La tesi di dottorato del dott. Hui era basata sullo studio dell'mRNA del liquido amniotico come espressione genica "fluido sommario" del feto che fornisce informazioni significative sullo sviluppo. Questo lavoro ha suggerito che le informazioni sul neurosviluppo fetale sono ottenibili dal liquido amniotico tramite trascrizioni specifiche del cervello fetale (mRNA) prive di cellule.

Se una donna a rischio di CMV congenito sceglie di sottoporsi a un'amniocentesi per la diagnosi di infezione fetale, questo campionamento offre l'opportunità di raccogliere un'aliquota di AF per l'analisi dell'RNA. Il sequenziamento dell'RNA (RNAseq) è una tecnologia relativamente nuova che consente un'analisi dettagliata dei geni che vengono espressi attivamente ("attivati") durante un particolare stato patologico. I ricercatori applicheranno metodi di sequenziamento dell'RNA al liquido amniotico per cercare potenziali differenze di espressione genica che potrebbero aiutare a comprendere la malattia attraverso l'analisi funzionale e identificare biomarcatori candidati per studi futuri.

Ipotesi che i feti infetti da CMV avranno un profilo di espressione genica alterato rispetto ai feti non infetti, come accertato nell'RNA privo di cellule del liquido amniotico.

Obiettivi Effettuare un'analisi comparativa dell'intero trascrittoma dell'RNA AF da feti infetti e non infetti da CMV utilizzando la tecnologia di sequenziamento dell'RNA.

Metodi Questo sarà uno studio multicentrico che coinvolgerà le unità di medicina fetale a Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) e Leuven (UZ Leuven, Leuven). Gli investigatori mirano a reclutare 20 donne (10 casi, 10 controlli) in 2 anni.

I campioni saranno raccolti durante l'amniocentesi clinicamente indicata eseguita allo scopo di diagnosticare la presenza o l'assenza di infezione congenita. Questo di solito viene eseguito a 20-21 settimane di gestazione per le donne con sieroconversione all'inizio della gravidanza, o al momento della valutazione fetale nei casi di rinvii con anomalie strutturali. Per lo studio di ricerca sarebbe richiesto un volume di liquido amniotico (AF) di 5-10 ml. Questo volume di campione non rappresenta un onere significativo per il medico che esegue la procedura (solo 10-20 secondi di tempo di raccolta aggiuntivo) e non aumenta il rischio della procedura per la gravidanza o la donna in quanto NON vi è inserimento aggiuntivo dell'ago (nessun aumento aborto spontaneo o impatto sul benessere fetale o materno).

Il campione di ricerca verrà conservato in una fiala separata dal campione clinico nei rispettivi siti di reclutamento. Viene conservato a 4 gradi Celsius e quindi centrifugato a 300 x g per 10 minuti entro 6 ore dalla raccolta. Il surnatante AF verrà prelevato e conservato in una provetta separata. Sia la porzione cellulare che il surnatante saranno congelati e conservati a -80°C. Il sito di reclutamento di Sydney trasporterà i campioni al laboratorio dell'Università di Melbourne presso il Mercy Hospital for Women su ghiaccio secco, dove verranno elaborati. A tutti i campioni verrà assegnato un numero ID del campione di studio prima del trasporto al laboratorio di ricerca dell'Università di Melbourne presso il Mercy Hospital for Women per proteggere la privacy dei partecipanti.

Verrà analizzato l'RNA totale da campioni di AF da 10 feti infetti da CMV e 10 non infetti, appaiati per età gestazionale e sesso fetale. L'RNA totale sarà estratto dai campioni di supernatante AF utilizzando il kit di estrazione dell'acido nucleico circolante Qiagen. Saranno eseguiti l'amplificazione dell'intero trascrittoma e il sequenziamento dell'RNA dell'RNA cell free ei profili di espressione del caso e dei gruppi di controllo saranno confrontati in un'analisi appaiata come eseguita in precedenti studi sull'RNA AF. L'analisi del percorso dei geni differenzialmente regolati sarà utilizzata per l'interpretazione biologica. I ricercatori impiegheranno sia un software commerciale ampiamente utilizzato (Ingenuity Pathway Analysis™) sia uno strumento di analisi funzionale specifico del feto sviluppato dai collaboratori della Tufts University (DFLAT).

Le trascrizioni cerebrali più down e up-regolate saranno identificate come biomarcatori candidati di esito anomalo per futuri studi di validazione.

Gli esiti della gravidanza fino a sei settimane dopo il parto per madre e bambino saranno raccolti dalla cartella clinica dell'ospedale, comprese le anomalie fetali rilevate su ecografia o risonanza magnetica, gestazione e modalità di nascita, peso alla nascita, uso di terapie prenatali (immunoglobulina CMV o altro), indagini neonatali come i risultati degli esami delle urine/saliva/del sangue del cordone ombelicale, l'ecografia cranica, l'esame obiettivo e i risultati dello screening dell'udito neonatale.

Risultati attesi: rispetto ai feti non infetti, i feti con infezione da CMV mostreranno vie di sviluppo neurologico ed espressione genica alterate all'analisi funzionale. Le trascrizioni specifiche del cervello fetale che sono espresse in modo differenziato nei feti con infezione da CMV saranno identificate come biomarcatori candidati dell'esito dello sviluppo neurologico per futuri studi di validazione.

Archiviazione e sicurezza dei dati Il database sarà istituito all'interno di RedCap (Research Electronic Data Capture), un'applicazione web gratuita, sicura e progettata per supportare l'acquisizione dei dati dei pazienti per gli studi di ricerca. Il servizio REDCap dell'Università di Melbourne fornisce criteri di archiviazione e backup sicuri conformi agli standard dell'Università e allo United States Health Information and Privacy Act. Solo i ricercatori dello studio avranno accesso a questo database.

Copie cartacee dei moduli di consenso e altre informazioni sullo studio saranno conservate in armadietti chiusi a chiave. Solo i ricercatori dello studio e l'HREC avranno accesso ai file.

6.0 Criteri di inclusione Le donne sottoposte a amniocentesi clinicamente indicata per sospetta infezione congenita da CMV attraverso il Dipartimento di medicina perinatale presso il Mercy Hospital for Women o il Royal Hospital for Women, Randwick saranno identificate dai referti della clinica perinatale dal Dr Hui o dal Dr Shand rispettivamente. Queste donne includeranno (i) donne con evidenza di infezione materna primaria da CMV durante la gravidanza (ii) feti con anomalie strutturali indicative di infezione congenita da CMV (come elencato in Hui L e Wood G. Esito perinatale dopo infezione materna primaria da citomegalovirus nel primo trimestre: un aggiornamento pratico e un aiuto di consulenza. 2015 Diagnosi prenatale; 35:1-7. ) Sarà ammissibile qualsiasi donna di lingua inglese di età pari o superiore a 18 anni in grado di fornire il proprio consenso informato.

I soggetti con infezione da CMV fetale confermata formeranno il gruppo dei casi. I feti senza evidenza di infezione congenita formeranno il gruppo di controllo. I feti strutturalmente anormali che sono CMV negativi saranno esclusi dall'analisi del gruppo di controllo. Il tasso di feti infetti rispetto a quelli non infetti dopo l'infezione materna è di circa il 40%, quindi prevediamo un rapporto ragionevole di casi e controlli per la dimensione del nostro campione target.

Il contatto iniziale sarà stabilito dal team clinico, ma verrà effettuato il follow-up da parte di un'ostetrica di ricerca per discutere in dettaglio lo studio di ricerca, telefonicamente o faccia a faccia dopo la consultazione clinica, ove possibile. Questo per ridurre al minimo i potenziali conflitti derivanti dal fatto che i medici ottengano il consenso del paziente per lo studio. I pazienti saranno rassicurati sul fatto che non avranno alcun obbligo di partecipare e che la loro decisione non influirà sulla loro assistenza clinica o sul rapporto con il loro medico curante Il consenso scritto e informato sarà ottenuto dalle donne prima della loro procedura e sarà archiviato in un archivio chiuso gabinetto nei rispettivi Dipartimenti di Medicina Perinatale.

Criteri di esclusione Donne che non danno il consenso, che non sono in grado di dare il consenso per le procedure mediche, che non parlano inglese o che hanno meno di 18 anni.

Analisi statistiche Dimensione del campione In generale, maggiore è il numero di repliche biologiche (maggiore dimensione del campione), più forti sono le deduzioni che possono essere fatte dai dati di espressione genica. La variazione biologica tra i campioni e la diffusione prevista dell'espressione genica differenziale sono fattori importanti che influenzano la dimensione ideale del campione. Per questo studio, i ricercatori non sanno in anticipo come sarebbero distribuiti i livelli di espressione genica, limitando così la nostra capacità di utilizzare algoritmi di dimensione del campione per esperimenti RNA-seq. Oltre alle restrizioni sulla disponibilità dei campioni discusse in precedenza, i costi elevati associati all'elaborazione in laboratorio limitavano la fattibilità dell'utilizzo di un gran numero di campioni AF.

I principali fattori che influenzano i calcoli formali della dimensione del campione per gli esperimenti di sequenziamento dell'RNA sono: profondità di sequenziamento, coefficiente di variazione, grandezza dell'espressione differenziale rilevata, tasso di falsi positivi e potenza. Supponendo una profondità di lettura media di 20, un coefficiente di variazione uguale all'interno del gruppo di 0,4, una dimensione dell'effetto di 2 volte, un tasso di falsi positivi di 0,05 e una potenza dell'80%, il numero di soggetti per gruppo richiesto è 7,1 Gli investigatori mirano quindi a un obiettivo minimo di dieci campioni per gruppo.

Analisi dell'espressione genica differenziale e analisi funzionale Un consulente specialista in bioinformatica all'interno del Translational Obstetric Group sarà disponibile per il supporto statistico e di analisi dei dati di espressione genica. Verranno identificati i geni che sono significativamente disregolati nei casi infetti da CMV rispetto ai controlli non infetti. Le analisi funzionali dei geni differenzialmente espressi saranno eseguite utilizzando il software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) versione 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity è un database curato manualmente che identifica i processi biologici sovrarappresentati in un determinato set di dati e calcola un punteggio di significatività per ciascun risultato utilizzando il test di Fisher della coda destra. Gli investigatori utilizzeranno anche un'annotazione funzionale specifica del feto pubblicamente disponibile "Developmental FunctionaL Annotation at Tufts" (DFLAT) che ha precedentemente dimostrato di migliorare l'interpretazione biologica dei set di dati perinatali (//dflat.cs.tufts.edu).2