Utveckling av potentiella biomarkörer för fostrets hjärnutveckling efter medfödd CMV-infektion

Motiv för studien Aktuella verktyg för att förutsäga perinatalt utfall efter fosterinfektion med CMV är mycket begränsade. Fostervattenprov erbjuds vanligtvis från 20 veckors graviditet för att diagnostisera fosterinfektion. Detta provtagning ger en möjlighet att undersöka nya metoder för att förutsäga perinatalt utfall.

Denna studie syftar till att utveckla en mRNA-baserad metod för att studera effekten av CMV på fostret under utveckling. Dr Huis doktorsavhandling baserades på studien av fostervatten-mRNA som ett genuttryck "sammanfattningsvätska" hos fostret som ger meningsfull information om utveckling. Detta arbete antydde att information om fostrets neuroutveckling kan erhållas från fostervatten via cellfria fetala hjärnspecifika transkript (mRNA).

Om en kvinna med risk för medfödd CMV väljer att göra en fostervattenprov för diagnos av fosterinfektion, ger denna provtagning möjlighet att samla in en alikvot AF för RNA-analys. RNA-sekvensering (RNAseq) är en relativt ny teknologi som möjliggör detaljerad analys av de gener som aktivt uttrycks ('påslagen') under ett visst sjukdomstillstånd. Utredarna kommer att tillämpa RNA-sekvenseringsmetoder på fostervatten för att söka efter potentiella genuttrycksskillnader som kan hjälpa till att förstå sjukdomen genom funktionell analys och identifiera kandidatbiomarkörer för framtida studier.

Hypotes att foster infekterade med CMV kommer att ha en förändrad genuttrycksprofil jämfört med icke-infekterade foster, vilket konstaterats i fostervattencellfritt RNA.

Syfte Att utföra jämförande heltranskriptomanalys av AF RNA från CMV-infekterade och oinfekterade foster med hjälp av RNA-sekvenseringsteknologi.

Metoder Detta kommer att vara en multicenterstudie som involverar fostermedicinska enheter i Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) och Leuven (UZ Leuven, Leuven). Utredarna siktar på att rekrytera 20 kvinnor (10 fall, 10 kontroller) under 2 år.

Prover kommer att samlas in under kliniskt indikerad fostervattenprov som utförs i syfte att diagnostisera närvaro eller frånvaro av medfödd infektion. Detta utförs vanligtvis vid 20-21 graviditetsvecka för kvinnor med serokonversion i tidig graviditet, eller vid tidpunkten för fosterbedömning vid remisser med strukturella avvikelser. En fostervattenvolym (AF) på 5-10 ml skulle krävas för forskningsstudien. Denna provvolym utgör inte en betydande börda för läkaren som utför proceduren (endast 10-20 sekunder extra insamlingstid) och ökar inte risken för ingreppet för graviditeten eller kvinnan eftersom det INTE finns något ytterligare nålinförande (ingen ökning av missfall eller påverkan på fostrets eller moderns välbefinnande).

Forskningsprovet kommer att förvaras i en separat injektionsflaska till det kliniska provet på respektive rekryteringsställe. Den förvaras vid 4 grader Celsius och centrifugeras sedan vid 300 x g i 10 minuter inom 6 timmar efter uppsamling. AF-supernatanten tas av och förvaras i ett separat rör. Både den cellulära delen och supernatanten kommer att frysas och förvaras vid -80°C. Rekryteringsplatsen i Sydney kommer att transportera proverna till University of Melbournes laboratorium vid Mercy Hospital for Women på torris, där de kommer att bearbetas. Alla prover kommer att ges ett ID-nummer för studieprovet innan de transporteras till University of Melbournes forskningslaboratorium vid Mercy Hospital for Women för att skydda deltagarnas integritet.

Totalt RNA från AF-prover från 10 CMV-infekterade och 10 oinfekterade foster, matchade för graviditetsålder och fosterkön, kommer att analyseras. Totalt RNA kommer att extraheras från AF-supernatantproverna kommer att utföras med Qiagen Circulating Nucleic Acid extraktionssats. Hela transkriptomamplifiering och RNA-sekvensering av cellfritt RNA kommer att utföras och expressionsprofilerna för fall- och kontrollgrupperna jämförs i en parad analys som utförts i tidigare studier av AF RNA. Väganalys av de differentiellt reglerade generna kommer att användas för den biologiska tolkningen. Utredarna kommer att använda både allmänt använd kommersiell programvara (Ingenuity Pathway Analysis™) och ett fosterspecifikt funktionellt analysverktyg utvecklat av medarbetare vid Tufts University (DFLAT).

De mest ned- och uppreglerade hjärntranskripten kommer att identifieras som kandidatbiomarkörer för onormalt utfall för framtida valideringsstudier.

Graviditetsresultat till sex veckor efter förlossningen för mor och barn kommer att samlas in från sjukhusets journal, inklusive fosteravvikelser som upptäckts på ultraljud eller MRI, graviditet och födelsesätt, födelsevikt, användning av prenatala terapier (CMV-immunoglobulin eller annat), undersökningar av nyfödda såsom urin/saliv/ navelsträngsblodprov, kranial ultraljud, fysisk undersökning och resultat av nyfödd hörselscreening.

Förväntade resultat: Jämfört med oinfekterade foster kommer CMV-infekterade foster att visa förändrade neuroutvecklingsvägar och genuttryck vid funktionell analys. Foster-hjärnspecifika transkript som är differentiellt uttryckta i CMV-infekterade foster kommer att identifieras som kandidatbiomarkörer för neuroutvecklingsresultat för framtida valideringsstudier.

Datalagring och säkerhet Databasen kommer att upprättas inom RedCap (Research Electronic Data Capture), en gratis, säker, webbaserad applikation utformad för att stödja insamling av patientdata för forskningsstudier. Tjänsten University of Melbourne REDCap tillhandahåller säker lagring och säkerhetskopiering som följer universitetets standarder och USA:s hälsoinformation och integritetslag. Endast studiens utredare kommer att ha tillgång till denna databas.

Papperskopior av samtyckesformulär och annan studieinformation kommer att förvaras i låsta arkivskåp. Endast studieutredarna och HREC kommer att ha tillgång till filerna.

6.0 Inklusionskriterier Kvinnor som genomgår kliniskt indikerad fostervattenprov för misstänkt medfödd CMV-infektion genom avdelningen för perinatal medicin vid Mercy Hospital for Women eller Royal Hospital for Women, Randwick kommer att identifieras från de perinatala klinikremisserna av Dr Hui respektive Dr Shand. Dessa kvinnor kommer att inkludera (i) kvinnor med tecken på moderns primära CMV-infektion under graviditeten (ii) foster med strukturella abnormiteter som tyder på medfödd CMV-infektion (som anges i Hui L och Wood G. Perinatalt utfall efter moderns primära cytomegalovirusinfektion under första trimestern: en praktisk uppdatering och rådgivning. 2015 Prenatal diagnostik; 35:1-7. ) Varje engelsktalande kvinna som är 18 år eller äldre som kan ge informerat samtycke kommer att vara berättigad.

Patienter med bekräftad fetal CMV-infektion kommer att utgöra fallgruppen. Foster utan tecken på medfödd infektion kommer att utgöra kontrollgruppen. Strukturellt onormala foster som är CMV-negativa kommer att uteslutas från kontrollgruppsanalysen. Andelen infekterade kontra icke-infekterade foster efter moderns infektion är cirka 40 %, så vi räknar med en rimlig andel fall och kontroller för vår målprovstorlek.

Den första kontakten kommer att tas av det kliniska teamet, men uppföljning av en forskningsbarnmorska för att diskutera forskningsstudien i detalj kommer att göras, antingen per telefon eller ansikte mot ansikte efter den kliniska konsultationen när så är möjligt. Detta för att minimera potentiella konflikter från att låta klinikerna få patientens samtycke till studien. Patienterna kommer att försäkras om att de inte är skyldiga att delta och att deras beslut inte kommer att påverka deras kliniska vård eller relation till sin behandlande läkare. Skriftligt informerat samtycke kommer att erhållas från kvinnor före ingreppet och lagras i en låst arkivering. skåp vid respektive avdelningar för perinatal medicin.

Uteslutningskriterier Kvinnor som inte ger sitt samtycke, som inte kan ge sitt samtycke till medicinska ingrepp, icke-engelsktalande eller som är under 18 år.

Statistiska analyser Provstorlek I allmänhet gäller att ju fler biologiska replikat (större provstorlek), desto starkare slutsatser kan dras från genuttrycksdata. Biologisk variation mellan prover och den förväntade spridningen av differentiellt genuttryck är viktiga faktorer som påverkar den ideala provstorleken. För denna studie vet utredarna inte i förväg hur nivåerna av genuttryck skulle fördelas, vilket begränsar vår förmåga att använda provstorleksalgoritmer för RNA-sekv-experiment. Utöver de begränsningar av provtillgänglighet som diskuterats ovan, begränsade de höga kostnaderna i samband med laboratoriebehandling möjligheten att använda ett stort antal AF-prover.

De viktigaste faktorerna som påverkar formella provstorleksberäkningar för RNA-sekvenseringsexperiment är: sekvenseringsdjup, variationskoefficient, storleken på detekterat differentiellt uttryck, falsk positiv frekvens och kraft. Om man antar ett genomsnittligt läsdjup på 20, lika inom gruppvariationskoefficienten 0,4, en effektstorlek på 2 gånger, 0,05 falska positiva frekvens och 80 % effekt, är antalet försökspersoner per grupp som krävs 7,1. Utredarna siktar därför på ett minimimål på tio prover per grupp.

Analys av differentiellt genuttryck och funktionsanalys En konsultspecialist inom bioinformatik inom Translational Obstetric Group kommer att finnas tillgänglig för statistiskt och analysstöd för genuttrycksdata. Gener som är signifikant dysregulerade i de CMV-infekterade fallen jämfört med icke-infekterade kontroller kommer att identifieras. Funktionella analyser av de differentiellt uttryckta generna kommer att utföras med hjälp av Ingenuity Pathways Analysis (IPA) version 9.0 programvara (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity är en manuellt kurerad databas som identifierar överrepresenterade biologiska processer i en given datamängd och beräknar ett signifikanspoäng för varje resultat med hjälp av Fishers test med rätt svans. Utredarna kommer också att använda en allmänt tillgänglig fosterspecifik funktionskommentar "Developmental Functional Annotation at Tufts" (DFLAT) som tidigare har visat sig förbättra biologisk tolkning av perinatala datamängder (http://dflat.cs.tufts.edu).2