Desenvolvimento de Biomarcadores Potenciais para o Desenvolvimento do Cérebro Fetal Após Infecção Congênita por CMV

Justificativa do estudo As ferramentas atuais para prever o resultado perinatal após infecção fetal por CMV são muito limitadas. A amniocentese geralmente é oferecida a partir de 20 semanas de gestação para diagnosticar a infecção fetal. Esta amostragem oferece uma oportunidade para investigar novas abordagens para prever o resultado perinatal.

Este estudo visa desenvolver uma abordagem baseada em mRNA para estudar o impacto do CMV no feto em desenvolvimento. A tese de doutorado do Dr. Hui foi baseada no estudo do mRNA do líquido amniótico como uma expressão gênica "fluido sumário" do feto que fornece informações significativas sobre o desenvolvimento. Este trabalho sugeriu que as informações sobre o neurodesenvolvimento fetal podem ser obtidas a partir do líquido amniótico por meio de transcrições específicas do cérebro fetal livres de células (mRNAs).

Se uma mulher com risco de CMV congênito optar por fazer uma amniocentese para diagnóstico de infecção fetal, essa amostragem oferece uma oportunidade de coletar uma alíquota de FA para análise de RNA. O sequenciamento de RNA (RNAseq) é uma tecnologia relativamente nova que permite a análise detalhada dos genes que são expressos ativamente ('ligados') durante um determinado estado de doença. Os investigadores aplicarão métodos de sequenciamento de RNA ao líquido amniótico para procurar possíveis diferenças na expressão gênica que possam auxiliar na compreensão da doença por meio de análise funcional e identificação de biomarcadores candidatos para estudos futuros.

Hipótese de que fetos infectados por CMV terão um perfil de expressão gênica alterado em comparação com fetos não infectados, conforme verificado no RNA livre de células do líquido amniótico.

Objectivos Realizar uma análise comparativa do transcriptoma completo do ARN de AF de fetos infectados e não infectados por CMV utilizando a tecnologia de sequenciação de ARN.

Métodos Este será um estudo multicêntrico envolvendo unidades de medicina fetal em Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) e Leuven (UZ Leuven, Leuven). Os investigadores pretendem recrutar 20 mulheres (10 casos, 10 controles) ao longo de 2 anos.

As amostras serão coletadas durante a amniocentese clinicamente indicada para fins de diagnóstico da presença ou ausência de infecção congênita. Isso geralmente é realizado entre 20 e 21 semanas de gestação para mulheres com soroconversão no início da gravidez ou no momento da avaliação fetal em casos de encaminhamentos com anormalidades estruturais. Um volume de líquido amniótico (AF) de 5-10ml seria necessário para o estudo de pesquisa. Este volume de amostra não representa um fardo significativo para o clínico que realiza o procedimento (apenas 10-20 segundos de tempo de coleta adicional) e não aumenta o risco do procedimento para a gravidez ou mulher, pois NÃO há inserção adicional de agulha (sem aumento na aborto espontâneo ou impacto no bem-estar fetal ou materno).

A amostra da pesquisa será armazenada em frasco separado da amostra clínica nos respectivos locais de recrutamento. É armazenado a 4 graus Celsius e depois centrifugado a 300 x g por 10 minutos dentro de 6 horas após a coleta. O sobrenadante AF será retirado e armazenado em um tubo separado. Tanto a porção celular quanto o sobrenadante serão congelados e armazenados a -80°C. O local de recrutamento de Sydney transportará as amostras para o laboratório da Universidade de Melbourne no Mercy Hospital for Women em gelo seco, onde serão processadas. Todas as amostras receberão um número de identificação de amostra do estudo antes do transporte para o laboratório de pesquisa da Universidade de Melbourne no Mercy Hospital for Women para proteger a privacidade das participantes.

O RNA total de amostras de FA de 10 fetos infectados por CMV e 10 não infectados, pareados por idade gestacional e sexo fetal, serão analisados. O RNA total será extraído das amostras de sobrenadante de AF usando o kit de extração Qiagen Circulating Nucleic Acid. A amplificação do transcriptoma total e o sequenciamento de RNA do RNA livre da célula serão realizados e os perfis de expressão dos grupos caso e controle comparados em uma análise pareada, conforme realizado em estudos anteriores de AF RNA. A análise de vias dos genes diferencialmente regulados será utilizada para a interpretação biológica. Os investigadores empregarão software comercial amplamente utilizado (Ingenuity Pathway Analysis™) e uma ferramenta de análise funcional específica do feto desenvolvida por colaboradores da Tufts University (DFLAT).

Os transcritos cerebrais mais regulados para baixo e para cima serão identificados como candidatos a biomarcadores de resultados anormais para futuros estudos de validação.

Os resultados da gravidez até seis semanas após o parto para a mãe e o bebê serão coletados do prontuário médico do hospital, incluindo anormalidades fetais detectadas em ultrassom ou ressonância magnética, gestação e tipo de parto, peso ao nascer, uso de terapias pré-natais (imunoglobulina CMV ou outras), investigações do recém-nascido como resultados de exames de urina/saliva/sangue do cordão umbilical, ultrassonografia craniana, exame físico e resultados da triagem auditiva neonatal.

Resultados esperados: Em comparação com fetos não infectados, os fetos infectados por CMV apresentarão vias de neurodesenvolvimento e expressão gênica alteradas na análise funcional. Os transcritos específicos do cérebro fetal que são diferencialmente expressos em fetos infectados por CMV serão identificados como candidatos a biomarcadores do resultado do neurodesenvolvimento para futuros estudos de validação.

Armazenamento e segurança de dados O banco de dados será configurado no RedCap (Research Electronic Data Capture), um aplicativo gratuito, seguro e baseado na Web projetado para oferecer suporte à captura de dados do paciente para estudos de pesquisa. O serviço REDCap da Universidade de Melbourne fornece armazenamento seguro e políticas de backup que cumprem os padrões da Universidade e a Lei de Privacidade e Informação de Saúde dos Estados Unidos. Somente os investigadores do estudo terão acesso a esse banco de dados.

Cópias impressas dos formulários de consentimento e outras informações do estudo serão mantidas em arquivos trancados. Somente os investigadores do estudo e o HREC terão acesso aos arquivos.

6.0 Critérios de inclusão As mulheres submetidas a amniocentese clinicamente indicada para suspeita de infecção congênita por CMV através do Departamento de Medicina Perinatal no Mercy Hospital for Women ou no Royal Hospital for Women, Randwick serão identificadas a partir dos encaminhamentos da clínica perinatal pelo Dr. Hui ou pelo Dr. Shand, respectivamente. Essas mulheres incluirão (i) mulheres com evidência de infecção materna primária por CMV durante a gravidez (ii) Fetos com anormalidades estruturais sugestivas de infecção congênita por CMV (conforme listado em Hui L e Wood G. Resultado perinatal após infecção materna primária por citomegalovírus no primeiro trimestre: uma atualização prática e auxílio de aconselhamento. 2015 Diagnóstico Pré-Natal; 35:1-7. ) Qualquer mulher de 18 anos ou mais que fale inglês e seja capaz de dar consentimento informado será elegível.

Indivíduos com infecção fetal confirmada por CMV formarão o grupo de casos. Fetos sem evidência de infecção congênita formarão o grupo controle. Fetos estruturalmente anormais que são CMV negativos serão excluídos da análise do grupo de controle. A taxa de fetos infectados versus não infectados após a infecção materna é de aproximadamente 40%, então prevemos uma proporção razoável de casos e controles para o tamanho da amostra alvo.

O contato inicial será feito pela equipe clínica, mas o acompanhamento por uma parteira pesquisadora para discutir o estudo em detalhes será feito por telefone ou pessoalmente após a consulta clínica, sempre que possível. Isso é para minimizar possíveis conflitos de ter os médicos obtendo o consentimento do paciente para o estudo. As pacientes serão asseguradas de que não terão nenhuma obrigação de participar e que sua decisão não afetará seus cuidados clínicos ou relacionamento com seu médico assistente O consentimento informado e por escrito será obtido das mulheres antes do procedimento e será armazenado em um arquivo fechado gabinete nos respectivos Departamentos de Medicina Perinatal.

Critérios de exclusão Mulheres que não dão consentimento, que não são capazes de dar consentimento para procedimentos médicos, que não falam inglês ou que têm menos de 18 anos de idade.

Análises estatísticas Tamanho da amostra Em geral, quanto mais replicações biológicas (maior tamanho da amostra), mais fortes as inferências que podem ser feitas a partir dos dados de expressão gênica. A variação biológica entre as amostras e a propagação esperada da expressão diferencial do gene são fatores importantes que influenciam o tamanho ideal da amostra. Para este estudo, os investigadores não sabem com antecedência como os níveis de expressão gênica seriam distribuídos, restringindo assim nossa capacidade de usar algoritmos de tamanho de amostra para experimentos de RNA-seq. Além das restrições na disponibilidade de amostras discutidas acima, os altos custos associados ao processamento laboratorial limitavam a viabilidade do uso de um grande número de amostras de AF.

Os principais fatores que influenciam os cálculos formais de tamanho de amostra para experimentos de sequenciamento de RNA são: profundidade do sequenciamento, coeficiente de variação, magnitude da expressão diferencial detectada, taxa e poder de falsos positivos. Assumindo profundidade de leitura média de 20, coeficiente de variação igual dentro do grupo de 0,4, um tamanho de efeito de 2 vezes, taxa de falso positivo de 0,05 e poder de 80%, o número de indivíduos por grupo necessário é de 7,1. Os investigadores, portanto, visam um alvo mínimo de dez amostras por grupo.

Análise da expressão gênica diferencial e análise funcional Um consultor especialista em bioinformática do Translational Obstetric Group estará disponível para suporte estatístico e análise dos dados de expressão gênica. Os genes que estão significativamente desregulados nos casos infectados por CMV em comparação com os controles não infectados serão identificados. As análises funcionais dos genes diferencialmente expressos serão realizadas usando o software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) Versão 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity é um banco de dados com curadoria manual que identifica processos biológicos super-representados em um determinado conjunto de dados e calcula uma pontuação de significância para cada resultado usando o teste de Fisher de cauda direita. Os investigadores também usarão uma anotação funcional específica do feto disponível publicamente "Developmental FunctionaL Annotation at Tufts" (DFLAT) que já demonstrou melhorar a interpretação biológica de conjuntos de dados perinatais (http://dflat.cs.tufts.edu).2