先天性 CMV 感染后胎儿大脑发育潜在生物标志物的开发

研究的基本原理 目前用于预测胎儿感染 CMV 后围产期结果的工具非常有限。 通常从妊娠 20 周开始进行羊膜穿刺术以诊断胎儿感染。 这种抽样提供了一个机会来研究预测围产期结果的新方法。

本研究旨在开发一种基于 mRNA 的方法来研究 CMV 对发育中胎儿的影响。 许博士的博士论文基于对羊水 mRNA 作为胎儿基因表达“总结液”的研究，该研究提供了有关发育的有意义信息。 这项工作表明，有关胎儿神经发育的信息可通过无细胞胎儿脑特异性转录物 (mRNA) 从羊水中获得。

如果有先天性 CMV 风险的妇女选择进行羊膜穿刺术以诊断胎儿感染，则该取样提供了收集 AF 等分试样用于 RNA 分析的机会。 RNA 测序 (RNAseq) 是一种相对较新的技术，可以详细分析在特定疾病状态下活跃表达（“开启”）的基因。 研究人员将对羊水应用 RNA 测序方法来寻找潜在的基因表达差异，这些差异可能有助于通过功能分析了解该疾病，并为未来的研究确定候选生物标志物。

假设 与未感染的胎儿相比，感染 CMV 的胎儿的基因表达谱发生了改变，这一点在羊水无细胞 RNA 中得到证实。

目的 使用 RNA 测序技术对来自 CMV 感染和未感染胎儿的 AF RNA 进行比较全转录组分析。

方法 这将是一项多中心研究，涉及墨尔本（Mercy Hospital for Women）、悉尼（Royal Hospital for Women, Randwick）和鲁汶（UZ Leuven, Leuven）的胎儿医学单位。 研究人员的目标是在 2 年内招募 20 名女性（10 名病例，10 名对照）。

将在临床指示的羊膜穿刺术期间收集样本，以诊断是否存在先天性感染。 对于早孕血清转化的妇女，通常在妊娠 20-21 周时进行，或者在结构异常转诊的情况下在胎儿评估时进行。 研究需要 5-10 毫升的羊水 (AF) 体积。 该样本量不会对执行该程序的临床医生造成重大负担（仅需要 10-20 秒的额外收集时间）并且不会增加怀孕或妇女的程序风险，因为没有额外的针头插入（不会增加流产或对胎儿或母亲健康的影响）。

研究样本将存储在单独的小瓶中，与各个招募地点的临床样本分开。 将其储存在 4 摄氏度，然后在收集后 6 小时内以 300 x g 离心 10 分钟。 AF 上清液将被取出并储存在单独的管中。 细胞部分和上清液都将冷冻并储存在 - 80°C。 悉尼招聘站点将用干冰将标本运送到位于墨尔本大学 Mercy Hospital for Women 的实验室，在那里进行处理。 在运送到墨尔本大学 Mercy Hospital for Women 研究实验室之前，所有样本都将获得一个研究样本 ID 号，以保护参与者的隐私。

将分析来自 10 个 CMV 感染胎儿和 10 个未感染胎儿的 AF 样品的总 RNA，匹配胎龄和胎儿性别。 使用 Qiagen 循环核酸提取试剂盒从 AF 上清液样品中提取总 RNA。 将对无细胞 RNA 进行全转录组扩增和 RNA 测序，并在先前对 AF RNA 的研究中进行的配对分析中比较病例组和对照组的表达谱。 差异调节基因的通路分析将用于生物学解释。 研究人员将使用广泛使用的商业软件 (Ingenuity Pathway Analysis™) 和由塔夫茨大学 (DFLAT) 的合作者开发的胎儿特异性功能分析工具。

下调和上调最多的大脑转录物将被确定为异常结果的候选生物标志物，用于未来的验证研究。

母亲和婴儿产后六周的妊娠结果将从医院病历中收集，包括超声或 MRI 检测到的胎儿异常、妊娠和分娩方式、出生体重、产前治疗（CMV 免疫球蛋白或其他）的使用、新生儿检查例如尿液/唾液/脐带血测试结果、头颅超声、体格检查和新生儿听力筛查结果。

预期结果：与未感染的胎儿相比，CMV 感染的胎儿在功能分析中将表现出神经发育途径和基因表达的改变。 在 CMV 感染的胎儿中差异表达的胎儿大脑特异性转录物将被确定为未来验证研究的神经发育结果的候选生物标志物。

数据存储和安全 该数据库将在 RedCap（研究电子数据采集）中建立，这是一个免费、安全、基于网络的应用程序，旨在支持患者数据采集以进行研究。 墨尔本大学 REDCap 服务提供符合大学标准和美国健康信息和隐私法的安全存储和备份政策。 只有研究调查人员才能访问该数据库。

同意书和其他研究信息的纸质副本将保存在上锁的文件柜中。 只有研究调查员和 HREC 才能访问这些文件。

6.0 纳入标准 因疑似先天性 CMV 感染而在慈善妇女医院或兰德威克皇家妇女医院的围产期医学科接受临床指示的羊膜穿刺术的妇女将分别从许医生或尚德医生的围产期诊所转诊中确定。 这些女性将包括 (i) 有孕期母体原发性 CMV 感染证据的女性 (ii) 结构异常提示先天性 CMV 感染的胎儿（如 Hui L 和 Wood G 所列。妊娠早期母体原发性巨细胞病毒感染后的围产期结果：实用的更新和咨询帮助。 2015年产前诊断； 35:1-7。 ) 任何 18 岁或以上能够给予知情同意的讲英语的女性都有资格。

确诊为胎儿 CMV 感染的受试者将组成病例组。 没有先天性感染证据的胎儿将作为对照组。 CMV 阴性的结构异常胎儿将从对照组分析中排除。 母体感染后受感染胎儿与未受感染胎儿的比率约为 40%，因此我们预计病例和对照的合理比例符合我们的目标样本量。

初步联系将由临床团队进行，但研究助产士将通过电话或尽可能在临床咨询后面对面进行详细讨论研究。 这是为了尽量减少临床医生获得患者同意进行研究的潜在冲突。 患者将放心，他们没有义务参与，他们的决定不会影响他们的临床护理或与他们的治疗医生的关系 在他们的程序之前，将获得妇女的书面知情同意，并存储在一个锁定的文件中内阁在各自的围产医学部门。

排除标准 不同意、不能同意医疗程序、不会说英语或未满 18 岁的女性。

统计分析 样本量 一般来说，生物学重复越多（样本量越大），可以从基因表达数据中做出的推论就越强。 样本之间的生物学差异和差异基因表达的预期传播是影响理想样本量的重要因素。 对于这项研究，研究人员事先并不知道基因表达水平将如何分布，因此限制了我们使用样本量算法进行 RNA-seq 实验的能力。 除了上面讨论的对样本可用性的限制外，与实验室处理相关的高成本限制了使用大量 AF 样本的可行性。

影响 RNA 测序实验正式样本量计算的主要因素是：测序深度、变异系数、检测到的差异表达量级、假阳性率和功效。 假设平均读取深度为 20，组内变异系数等于 0.4，效应大小为 2 倍，假阳性率为 0.05 且功效为 80%，则每组所需的受试者数量为 7.1 因此，研究人员的目标是最低目标每组十个样本。

差异基因表达分析和功能分析 转化产科组内的顾问生物信息学专家将为基因表达数据提供统计和分析支持。 与未感染对照相比，CMV 感染病例中显着失调的基因将被鉴定。 差异表达基因的功能分析将使用 Ingenuity Pathways Analysis (IPA) 9.0 版软件（Ingenuity；Redwood City，CA）进行。 Ingenuity 是一个手动管理的数据库，可识别给定数据集中过度表示的生物过程，并使用右尾 Fisher 检验计算每个结果的显着性分数。 研究人员还将使用公开可用的胎儿特定功能注释“塔夫茨大学的发育功能注释”(DFLAT)，该注释先前已被证明可以增强围产期数据集的生物学解释 (http://dflat.cs.tufts.edu)。2