Potenciális biomarkerek fejlesztése a magzati agy fejlődéséhez veleszületett CMV-fertőzés után

A vizsgálat indoklása A magzati CMV-fertőzés utáni perinatális kimenetel előrejelzésére szolgáló jelenlegi eszközök nagyon korlátozottak. Az amniocentézist általában a terhesség 20. hetétől ajánlják fel a magzati fertőzés diagnosztizálására. Ez a mintavétel lehetőséget ad a perinatális kimenetel előrejelzésének újszerű megközelítéseinek vizsgálatára.

A tanulmány célja egy mRNS-alapú megközelítés kidolgozása a CMV fejlődő magzatra gyakorolt ​​hatásának tanulmányozására. Dr. Hui doktori disszertációja a magzatvíz mRNS-ének vizsgálatán alapult, mint a magzat génexpressziós „összefoglaló folyadékaként”, amely érdemi információkat nyújt a fejlődésről. Ez a munka azt sugallta, hogy a magzati idegrendszer fejlődésével kapcsolatos információk a magzatvízből nyerhetők sejtmentes magzati agyspecifikus transzkriptumokon (mRNS-ek) keresztül.

Ha a veleszületett CMV kockázatának kitett nő úgy dönt, hogy magzatvíz-vizsgálatot végez a magzati fertőzés diagnosztizálására, ez a mintavétel lehetőséget biztosít az AF alikvot részének gyűjtésére RNS-elemzés céljából. Az RNS-szekvenálás (RNAseq) egy viszonylag új technológia, amely lehetővé teszi azon gének részletes elemzését, amelyek egy adott betegségi állapot során aktívan expresszálódnak („bekapcsolódnak”). A kutatók RNS-szekvenálási módszereket alkalmaznak a magzatvízben, hogy olyan lehetséges génexpressziós különbségeket keressenek, amelyek funkcionális elemzésen keresztül segíthetik a betegség megértését, és azonosítják a biomarkerjelölteket a jövőbeli vizsgálatokhoz.

Az a hipotézis, hogy a CMV-vel fertőzött magzatok génexpressziós profilja megváltozik a nem fertőzött magzatokhoz képest, amint azt a magzatvíz sejtmentes RNS-e megállapítja.

Célok CMV-vel fertőzött és nem fertőzött magzatokból származó AF RNS összehasonlító teljes transzkriptom elemzése RNS szekvenálási technológia segítségével.

Módszerek Ez egy többközpontú vizsgálat lesz, amelyben magzatgyógyászati ​​osztályok vesznek részt Melbourne-ben (Mercy Hospital for Women), Sydneyben (Királyi Női Kórház, Randwick) és Leuvenben (UZ Leuven, Leuven). A nyomozók célja 20 nő toborzása (10 eset, 10 kontroll) 2 év alatt.

A veleszületett fertőzés jelenlétének vagy hiányának diagnosztizálása céljából végzett klinikailag indikált magzatvíz vizsgálat során mintákat gyűjtenek. Ezt általában a terhesség 20-21. hetében végzik el a terhesség korai szakaszában szerokonverzión átesett nőknél, illetve a magzati vizsgálat időpontjában szerkezeti rendellenességgel járó beutalások esetén. A kutatáshoz 5-10 ml magzatvíz (AF) térfogatra lenne szükség. Ez a mintamennyiség nem jelent jelentős terhet az eljárást végző klinikusra (csak 10-20 másodperc további gyűjtési idő), és nem növeli a beavatkozás kockázatát a terhesség vagy a nő számára, mivel NINCS további tűszúrás (nem nő a tű. vetélés vagy a magzati vagy anyai jólétre gyakorolt ​​hatás).

A kutatási mintát a klinikai mintához külön fiolában tárolják a megfelelő felvételi helyeken. 4 Celsius-fokon tároljuk, majd 300 x g-vel 10 percig centrifugáljuk a begyűjtést követő 6 órán belül. Az AF felülúszót eltávolítják és egy külön csőben tárolják. Mind a sejtes részt, mind a felülúszót lefagyasztjuk és -80 °C-on tároljuk. A sydney-i toborzóhely szárazjégen szállítja a mintákat a Melbourne-i Egyetem laboratóriumába a Mercy Hospital for Women-ben, ahol feldolgozzák őket. A résztvevők magánéletének védelme érdekében minden minta vizsgálati mintaazonosító számot kap, mielőtt a Melbourne-i Egyetem kutatólaboratóriumába szállítják a Mercy Hospital for Women-ben.

10 CMV-fertőzött és 10 nem fertőzött magzat AF-mintáiból származó teljes RNS-t elemzik, a terhességi kor és a magzati nem alapján. Az AF felülúszó mintákból a teljes RNS-t kivonják a Qiagen Circulating Nucleic Acid extrakciós kit segítségével. A sejtmentes RNS teljes transzkripciós amplifikációját és RNS-szekvenálását végezzük el, és az eset- és kontrollcsoportok expressziós profilját hasonlítjuk össze egy páros elemzésben, amint azt az AF RNS korábbi vizsgálataiban végeztük. A biológiai interpretációhoz a differenciálisan szabályozott gének útvonalanalízisét használjuk. A kutatók széles körben használt kereskedelmi szoftvert (Ingenuity Pathway Analysis™), valamint a Tufts Egyetem munkatársai által kifejlesztett magzatspecifikus funkcionális elemző eszközt (DFLAT) is alkalmaznak.

A leginkább le- és felfelé szabályozott agyi transzkriptumokat a kóros kimenetelű jelölt biomarkerekként azonosítják a jövőbeli validációs vizsgálatokhoz.

A szülés utáni hat hétig az anya és a baba terhességi eredményeit a kórházi kórlapból gyűjtik össze, beleértve az ultrahanggal vagy MRI-vel észlelt magzati rendellenességeket, a terhességet és a születési módot, a születési súlyt, a prenatális terápiák alkalmazását (CMV immunglobulin vagy más), az újszülött vizsgálatokat. vizelet/nyál/köldökzsinórvér vizsgálati eredmények, koponya-ultrahang, fizikális vizsgálat és újszülöttek hallásszűrésének eredményei.

Várt eredmények: A nem fertőzött magzatokhoz képest a CMV-vel fertőzött magzatok megváltozott idegrendszeri fejlődési útvonalakat és génexpressziót mutatnak a funkcionális elemzés során. A CMV-fertőzött magzatokban eltérően expresszálódó magzat-agy-specifikus transzkriptumokat az idegfejlődési eredmények jelölt biomarkereiként azonosítják a jövőbeni validációs vizsgálatok során.

Adattárolás és biztonság Az adatbázist a RedCap (Research Electronic Data Capture) keretén belül hozzuk létre, amely egy ingyenes, biztonságos, webalapú alkalmazás, amelyet a kutatási vizsgálatokhoz szükséges páciensadatok rögzítésére terveztek. A Melbourne Egyetem REDCap szolgáltatása biztonságos tárolási és biztonsági mentési szabályzatot biztosít, amely megfelel az egyetemi szabványoknak és az Egyesült Államok egészségügyi információi és adatvédelmi törvényének. Csak a vizsgálatot végzők férhetnek hozzá ehhez az adatbázishoz.

A beleegyezési űrlapok nyomtatott példányait és a tanulmányokkal kapcsolatos egyéb információkat zárt iratszekrényekben tárolják. Csak a vizsgálatot végzők és a HREC férhetnek hozzá az aktákhoz.

6.0 Bevételi kritériumok Azokat a nőket, akiknél klinikailag indikált magzatvíz vizsgálaton esnek át veleszületett CMV-fertőzés gyanúja miatt a Mercy Hospital for Women vagy a Royal Hospital for Women, Randwick Perinatal Medicine Osztályán keresztül Dr. Hui vagy Dr. Shand a perinatális klinika beutalói alapján. Ezek a nők magukban foglalják (i) azokat a nőket, akiknél az anyai elsődleges CMV-fertőzés a terhesség alatt fennáll; (ii) a veleszületett CMV-fertőzésre utaló szerkezeti rendellenességekkel rendelkező magzatok (a Hui L-ben és Wood G-ben felsoroltak szerint. Perinatális kimenetel az anyai elsődleges citomegalovírus-fertőzés után az első trimeszterben: gyakorlati frissítési és tanácsadási segédlet. 2015 Prenatális Diagnosztika; 35:1-7. ) Bármely 18 éves vagy annál idősebb, angolul beszélő nő jogosult, aki képes beleegyezését adni.

A megerősített magzati CMV fertőzésben szenvedő alanyok alkotják az esetcsoportot. A veleszületett fertőzésre utaló jelek nélküli magzatok alkotják a kontrollcsoportot. A szerkezetileg rendellenes magzatokat, amelyek CMV-negatívak, kizárják a kontrollcsoport elemzéséből. Az anyai fertőzést követően a fertőzött és a nem fertőzött magzatok aránya hozzávetőleg 40%, ezért a megcélzott mintanagysághoz megfelelő arányú eseteket és kontrollokat várunk.

A kezdeti kapcsolatfelvételt a klinikai csapat veszi fel, de lehetőség szerint telefonon vagy személyesen a klinikai konzultációt követően egy kutató szülésznő nyomon követi a kutatási vizsgálat részleteit. Ennek célja, hogy minimalizálja a lehetséges konfliktusokat, amelyek abból erednek, hogy a klinikusok megkapják a páciens beleegyezését a vizsgálathoz. A betegeket megnyugtatják arról, hogy nem kötelesek részt venni, és döntésük nem befolyásolja klinikai ellátásukat vagy a kezelőorvosukkal való kapcsolatukat. kabinet a megfelelő perinatális orvosi osztályokon.

Kizárási kritériumok Nők, akik nem adnak beleegyezést, akik nem képesek beleegyezést adni az orvosi eljárásokhoz, nem beszélnek angolul, vagy 18 éven aluliak.

Statisztikai elemzések Mintanagyság Általánosságban elmondható, hogy minél több biológiai ismétlés (nagyobb mintaméret), annál erősebb következtetéseket lehet levonni a génexpressziós adatokból. A minták közötti biológiai eltérések és a differenciális génexpresszió várható terjedése fontos tényezők, amelyek befolyásolják az ideális mintaméretet. Ehhez a vizsgálathoz a kutatók nem tudják előre, hogy a génexpressziós szintek hogyan oszlanak el, így korlátozva a lehetőségünket arra, hogy mintaméret-algoritmusokat használjunk az RNS-seq kísérletekhez. A minták elérhetőségére vonatkozó fent tárgyalt korlátozásokon túlmenően a laboratóriumi feldolgozás magas költségei korlátozták a nagyszámú AF-minta felhasználásának megvalósíthatóságát.

Az RNS-szekvenálási kísérletek formális mintaméret-számítását befolyásoló fő tényezők: a szekvenálás mélysége, a variációs együttható, a detektált differenciális expresszió nagysága, a hamis pozitív arány és a teljesítmény. 20-as átlagos olvasási mélységet, 0,4-es csoporton belüli variációs együtthatót, 2-szeres hatásméretet, 0,05 téves pozitív arányt és 80%-os teljesítményt feltételezve a csoportonkénti szükséges alanyok száma 7,1. Ezért a vizsgálók célja a minimális cél: csoportonként tíz minta.

Differenciális génexpresszió elemzése és funkcionális elemzés A Translational Obstetric Group tanácsadó bioinformatikus szakembere áll majd rendelkezésre a génexpressziós adatok statisztikai és elemzési támogatására. Azonosítani fogjuk azokat a géneket, amelyek a CMV-vel fertőzött esetekben jelentősen szabályozatlanok a nem fertőzött kontrollokhoz képest. A differenciálisan expresszált gének funkcionális elemzését az Ingenuity Pathways Analysis (IPA) 9.0-s verziójú szoftverrel (Ingenuity; Redwood City, CA) végezzük. Az Ingenuity egy manuálisan összeállított adatbázis, amely azonosítja a túlreprezentált biológiai folyamatokat egy adott adathalmazban, és minden eredményhez szignifikancia-pontszámot számol a megfelelő farkú Fisher-teszt segítségével. A kutatók egy nyilvánosan elérhető, magzatspecifikus funkcionális megjegyzést is fognak használni „Developmental FunctionaL Annotation at Tufts” (DFLAT), amelyről korábban kimutatták, hogy javítja a perinatális adatkészletek biológiai értelmezését (http://dflat.cs.tufts.edu).2