Entwicklung potenzieller Biomarker für die fötale Gehirnentwicklung nach angeborener CMV-Infektion

Begründung der Studie Die derzeitigen Instrumente zur Vorhersage des perinatalen Outcomes nach fetaler Infektion mit CMV sind sehr begrenzt. Amniozentese wird normalerweise ab der 20. Schwangerschaftswoche angeboten, um eine fetale Infektion zu diagnostizieren. Diese Probenahme bietet die Möglichkeit, neue Ansätze zur Vorhersage des perinatalen Ergebnisses zu untersuchen.

Diese Studie zielt darauf ab, einen mRNA-basierten Ansatz zur Untersuchung der Auswirkungen von CMV auf den sich entwickelnden Fötus zu entwickeln. Die Doktorarbeit von Dr. Hui basierte auf der Untersuchung der Fruchtwasser-mRNA als Genexpressions-"Zusammenfassungsflüssigkeit" des Fötus, die aussagekräftige Informationen über die Entwicklung liefert. Diese Arbeit legt nahe, dass Informationen über die fötale Neuroentwicklung aus Fruchtwasser über zellfreie fötale gehirnspezifische Transkripte (mRNAs) erhältlich sind.

Wenn sich eine Frau mit einem Risiko für angeborenes CMV für eine Amniozentese zur Diagnose einer fetalen Infektion entscheidet, bietet diese Probenahme die Möglichkeit, ein Aliquot von AF für die RNA-Analyse zu entnehmen. Die RNA-Sequenzierung (RNAseq) ist eine relativ neue Technologie, die eine detaillierte Analyse der Gene ermöglicht, die während eines bestimmten Krankheitszustands aktiv exprimiert („angeschaltet“) werden. Die Forscher werden RNA-Sequenzierungsmethoden auf Fruchtwasser anwenden, um nach potenziellen Unterschieden in der Genexpression zu suchen, die zum Verständnis der Krankheit durch funktionelle Analyse und zur Identifizierung von Biomarkerkandidaten für zukünftige Studien beitragen können.

Hypothese, dass mit CMV infizierte Föten im Vergleich zu nicht infizierten Föten ein verändertes Genexpressionsprofil aufweisen, wie in zellfreier RNA des Fruchtwassers festgestellt wurde.

Ziele Durchführung einer vergleichenden Analyse des gesamten Transkriptoms von AF-RNA von CMV-infizierten und nicht infizierten Föten unter Verwendung von RNA-Sequenzierungstechnologie.

Methoden Dies wird eine multizentrische Studie sein, an der Einheiten für fetale Medizin in Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) und Leuven (UZ Leuven, Leuven) beteiligt sind. Die Ermittler zielen darauf ab, 20 Frauen (10 Fälle, 10 Kontrollen) über 2 Jahre zu rekrutieren.

Die Proben werden während einer klinisch indizierten Amniozentese entnommen, die zum Zwecke der Diagnose des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins einer angeborenen Infektion durchgeführt wird. Dies wird normalerweise in der 20. bis 21. Schwangerschaftswoche bei Frauen mit Serokonversion in der Frühschwangerschaft oder zum Zeitpunkt der fetalen Untersuchung bei Überweisungen mit strukturellen Anomalien durchgeführt. Für die Forschungsstudie wäre ein Fruchtwasservolumen (AF) von 5–10 ml erforderlich. Dieses Probenvolumen stellt keine erhebliche Belastung für den Arzt dar, der das Verfahren durchführt (nur 10-20 Sekunden zusätzliche Entnahmezeit) und erhöht das Risiko des Verfahrens für die Schwangerschaft oder Frau nicht, da KEINE zusätzliche Nadeleinführung erforderlich ist (keine Erhöhung der Fehlgeburt oder Auswirkungen auf das Wohlbefinden des Fötus oder der Mutter).

Die Forschungsprobe wird in einem separaten Fläschchen zur klinischen Probe an den jeweiligen Rekrutierungsstellen aufbewahrt. Es wird bei 4 Grad Celsius gelagert und dann innerhalb von 6 Stunden nach der Entnahme 10 Minuten lang bei 300 x g zentrifugiert. Der AF-Überstand wird abgenommen und in einem separaten Röhrchen aufbewahrt. Sowohl der Zellanteil als auch der Überstand werden eingefroren und bei –80°C gelagert. Die Rekrutierungsstelle in Sydney wird die Proben auf Trockeneis zum Labor der University of Melbourne im Mercy Hospital for Women transportieren, wo sie verarbeitet werden. Alle Proben erhalten vor dem Transport zum Forschungslabor der University of Melbourne im Mercy Hospital for Women eine Studienproben-ID-Nummer, um die Privatsphäre der Teilnehmer zu schützen.

Gesamt-RNA aus AF-Proben von 10 CMV-infizierten und 10 nicht-infizierten Föten, abgestimmt auf Gestationsalter und fötales Geschlecht, wird analysiert. Die Gesamt-RNA wird aus den AF-Überstandsproben mit dem Qiagen Circulating Nucleic Acid Extraction Kit extrahiert. Es werden eine Amplifikation des gesamten Transkriptoms und eine RNA-Sequenzierung der zellfreien RNA durchgeführt und die Expressionsprofile der Fall- und Kontrollgruppen in einer gepaarten Analyse verglichen, wie sie in früheren Studien zu AF-RNA durchgeführt wurde. Pathway-Analysen der differentiell regulierten Gene dienen der biologischen Interpretation. Die Forscher werden sowohl weit verbreitete kommerzielle Software (Ingenuity Pathway Analysis™) als auch ein fötusspezifisches Funktionsanalysetool einsetzen, das von Mitarbeitern der Tufts University (DFLAT) entwickelt wurde.

Die am stärksten herunter- und hochregulierten Gehirntranskripte werden als mögliche Biomarker für abnormale Ergebnisse für zukünftige Validierungsstudien identifiziert.

Schwangerschaftsergebnisse bis sechs Wochen nach der Geburt für Mutter und Kind werden aus der Krankenakte des Krankenhauses erfasst, einschließlich fötaler Anomalien, die im Ultraschall oder MRT festgestellt wurden, Schwangerschaft und Geburtsmodus, Geburtsgewicht, Anwendung pränataler Therapien (CMV-Immunglobulin oder andere), Neugeborenenuntersuchungen wie Ergebnisse von Urin-/Speichel-/Nabelschnurblutuntersuchungen, Schädelultraschall, körperliche Untersuchung und Ergebnisse des Neugeborenen-Hörscreenings.

Erwartete Ergebnisse: Im Vergleich zu nicht infizierten Föten zeigen CMV-infizierte Föten bei der funktionellen Analyse veränderte neurologische Entwicklungswege und Genexpression. Fötale Gehirn-spezifische Transkripte, die in CMV-infizierten Föten differentiell exprimiert werden, werden als mögliche Biomarker für neurologische Entwicklungsergebnisse für zukünftige Validierungsstudien identifiziert.

Datenspeicherung und -sicherheit Die Datenbank wird innerhalb von RedCap (Research Electronic Data Capture) eingerichtet, einer kostenlosen, sicheren, webbasierten Anwendung zur Unterstützung der Patientendatenerfassung für Forschungsstudien. Der REDCap-Dienst der University of Melbourne bietet sichere Speicher- und Sicherungsrichtlinien, die den Universitätsstandards und dem United States Health Information and Privacy Act entsprechen. Nur die Prüfärzte der Studie haben Zugriff auf diese Datenbank.

Ausdrucke der Einverständniserklärungen und anderer Studieninformationen werden in verschlossenen Aktenschränken aufbewahrt. Nur die Prüfer der Studie und das HREC haben Zugriff auf die Akten.

6.0 Einschlusskriterien Frauen, die sich einer klinisch indizierten Amniozentese wegen Verdachts auf eine angeborene CMV-Infektion durch die Abteilung für Perinatalmedizin des Mercy Hospital for Women oder des Royal Hospital for Women, Randwick, unterziehen, werden anhand der Überweisungen der Perinatalklinik von Dr. Hui bzw. Dr. Shand identifiziert. Zu diesen Frauen gehören (i) Frauen mit Anzeichen einer primären CMV-Infektion der Mutter während der Schwangerschaft (ii) Föten mit strukturellen Anomalien, die auf eine angeborene CMV-Infektion hindeuten (wie in Hui L. und Wood G. aufgeführt. Perinatales Ergebnis nach primärer CMV-Infektion der Mutter im ersten Trimester: ein praktisches Update und eine Beratungshilfe. 2015 Pränataldiagnostik; 35:1-7. ) Jede englischsprachige Frau ab 18 Jahren, die in der Lage ist, eine Einverständniserklärung abzugeben, ist teilnahmeberechtigt.

Probanden mit bestätigter fetaler CMV-Infektion bilden die Fallgruppe. Föten ohne Anzeichen einer angeborenen Infektion bilden die Kontrollgruppe. Strukturell abnormale Föten, die CMV-negativ sind, werden von der Kontrollgruppenanalyse ausgeschlossen. Die Rate infizierter vs. nicht infizierter Föten nach einer mütterlichen Infektion beträgt etwa 40 %, sodass wir für unsere angestrebte Stichprobengröße ein angemessenes Verhältnis von Fällen und Kontrollen erwarten.

Der erste Kontakt wird durch das klinische Team hergestellt, aber eine Nachbereitung durch eine Forschungshebamme, um die Forschungsstudie im Detail zu besprechen, erfolgt nach Möglichkeit entweder telefonisch oder persönlich nach der klinischen Konsultation. Dies dient dazu, potenzielle Konflikte zu minimieren, wenn die Kliniker die Einwilligung des Patienten für die Studie einholen müssen. Den Patienten wird versichert, dass sie nicht zur Teilnahme verpflichtet sind und dass ihre Entscheidung ihre klinische Versorgung oder die Beziehung zu ihrem behandelnden Arzt nicht beeinträchtigen wird. Von Frauen wird vor ihrem Eingriff eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt und in einer verschlossenen Akte aufbewahrt Kabinett in den jeweiligen Abteilungen für Perinatalmedizin.

Ausschlusskriterien Frauen, die keine Einwilligung erteilen, die nicht in der Lage sind, medizinischen Verfahren zuzustimmen, die nicht Englisch sprechen oder die unter 18 Jahre alt sind.

Statistische Analysen Stichprobenumfang Im Allgemeinen gilt: Je mehr biologische Replikate (größerer Stichprobenumfang), desto stärker die Rückschlüsse, die aus den Genexpressionsdaten gezogen werden können. Die biologische Variation zwischen den Proben und die erwartete Ausbreitung der differentiellen Genexpression sind wichtige Faktoren, die die ideale Probengröße beeinflussen. Für diese Studie wissen die Forscher nicht im Voraus, wie sich die Genexpressionsniveaus verteilen würden, was unsere Fähigkeit einschränkt, Stichprobengrößenalgorithmen für RNA-seq-Experimente zu verwenden. Zusätzlich zu den oben diskutierten Beschränkungen der Probenverfügbarkeit schränkten die hohen Kosten im Zusammenhang mit der Laborverarbeitung die Machbarkeit der Verwendung einer großen Anzahl von AF-Proben ein.

Die Hauptfaktoren, die die formalen Berechnungen der Stichprobengröße für RNA-Sequenzierungsexperimente beeinflussen, sind: Sequenzierungstiefe, Variationskoeffizient, Größe der erkannten differentiellen Expression, falsch positive Rate und Leistung. Unter der Annahme einer durchschnittlichen Lesetiefe von 20, einem Variationskoeffizienten innerhalb der Gruppe von 0,4, einer Effektgröße von 2-fach, einer Falsch-Positiv-Rate von 0,05 und einer Aussagekraft von 80 % beträgt die Anzahl der erforderlichen Probanden pro Gruppe 7,1. Die Forscher streben daher ein Mindestziel von an zehn Proben pro Gruppe.

Analyse der differentiellen Genexpression und Funktionsanalyse Ein beratender Bioinformatik-Spezialist innerhalb der Translational Obstetric Group wird für die statistische und analytische Unterstützung der Genexpressionsdaten zur Verfügung stehen. Gene, die in den CMV-infizierten Fällen im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen signifikant fehlreguliert sind, werden identifiziert. Funktionsanalysen der differentiell exprimierten Gene werden unter Verwendung der Software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) Version 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA) durchgeführt. Ingenuity ist eine manuell kuratierte Datenbank, die überrepräsentierte biologische Prozesse in einem bestimmten Datensatz identifiziert und mithilfe des rechtsseitigen Fisher-Tests einen Signifikanzwert für jedes Ergebnis berechnet. Die Ermittler werden auch eine öffentlich verfügbare fötusspezifische funktionelle Annotation „Developmental FunctionaL Annotation at Tufts“ (DFLAT) verwenden, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie die biologische Interpretation perinataler Datensätze verbessert (http://dflat.cs.tufts.edu).2