Desarrollo de biomarcadores potenciales para el desarrollo del cerebro fetal después de una infección congénita por CMV

Justificación del estudio Las herramientas actuales para la predicción del resultado perinatal después de la infección fetal por CMV son muy limitadas. La amniocentesis generalmente se ofrece a partir de las 20 semanas de gestación para diagnosticar una infección fetal. Este muestreo brinda la oportunidad de investigar enfoques novedosos para predecir el resultado perinatal.

Este estudio tiene como objetivo desarrollar un enfoque basado en ARNm para estudiar el impacto de CMV en el feto en desarrollo. La tesis doctoral del Dr. Hui se basó en el estudio del ARNm del líquido amniótico como un "líquido de resumen" de expresión génica del feto que proporciona información significativa sobre el desarrollo. Este trabajo sugirió que la información sobre el neurodesarrollo fetal se puede obtener del líquido amniótico a través de transcritos específicos del cerebro fetal (ARNm) libres de células.

Si una mujer con riesgo de CMV congénito elige someterse a una amniocentesis para el diagnóstico de infección fetal, esta muestra brinda la oportunidad de recolectar una alícuota de AF para el análisis de ARN. La secuenciación de ARN (RNAseq) es una tecnología relativamente nueva que permite un análisis detallado de los genes que se expresan activamente ("encendidos") durante un estado de enfermedad particular. Los investigadores aplicarán métodos de secuenciación de ARN al líquido amniótico para buscar posibles diferencias en la expresión génica que puedan ayudar a comprender la enfermedad a través del análisis funcional y la identificación de biomarcadores candidatos para estudios futuros.

Hipótesis de que los fetos infectados con CMV tendrán un perfil de expresión génica alterado en comparación con los fetos no infectados, como se determina en el ARN libre de células del líquido amniótico.

Objetivos Realizar un análisis comparativo del transcriptoma completo del ARN de AF de fetos infectados y no infectados por CMV utilizando tecnología de secuenciación de ARN.

Métodos Este será un estudio multicéntrico que involucrará unidades de medicina fetal en Melbourne (Mercy Hospital for Women), Sydney (Royal Hospital for Women, Randwick) y Lovaina (UZ Leuven, Lovaina). El objetivo de los investigadores es reclutar a 20 mujeres (10 casos, 10 controles) durante 2 años.

Las muestras se recolectarán durante la amniocentesis clínicamente indicada realizada con el fin de diagnosticar la presencia o ausencia de infección congénita. Esto generalmente se realiza a las 20-21 semanas de gestación para mujeres con seroconversión en el embarazo temprano, o en el momento de la evaluación fetal en casos de derivaciones con anomalías estructurales. Se requeriría un volumen de líquido amniótico (AF) de 5 a 10 ml para el estudio de investigación. Este volumen de muestra no representa una carga significativa para el médico que realiza el procedimiento (solo 10-20 segundos de tiempo de recolección adicional) y no aumenta el riesgo del procedimiento para el embarazo o la mujer, ya que NO hay inserción de aguja adicional (no aumenta el tiempo de recolección). aborto espontáneo o impacto en el bienestar fetal o materno).

La muestra de investigación se almacenará en un vial separado de la muestra clínica en los respectivos sitios de reclutamiento. Se almacena a 4 grados centígrados y luego se centrifuga a 300 x g durante 10 minutos dentro de las 6 horas posteriores a la recolección. El sobrenadante de AF se retirará y almacenará en un tubo separado. Tanto la porción celular como el sobrenadante se congelarán y almacenarán a -80°C. El sitio de reclutamiento de Sydney transportará las muestras al laboratorio de la Universidad de Melbourne en el Mercy Hospital for Women en hielo seco, donde serán procesadas. Todas las muestras recibirán un número de identificación de la muestra del estudio antes del transporte al laboratorio de investigación de la Universidad de Melbourne en el Mercy Hospital for Women para proteger la privacidad de los participantes.

Se analizará el ARN total de muestras de FA de 10 fetos infectados con CMV y 10 no infectados, emparejados por edad gestacional y sexo fetal. El ARN total se extraerá del sobrenadante de AF. Las muestras se realizarán con el kit de extracción de ácido nucleico circulante de Qiagen. Se realizará la amplificación del transcriptoma completo y la secuenciación del ARN del ARN libre de células y se compararán los perfiles de expresión de los grupos de casos y controles en un análisis emparejado como se realizó en estudios previos de ARN de AF. Para la interpretación biológica se utilizará el análisis de vías de los genes regulados diferencialmente. Los investigadores emplearán software comercial ampliamente utilizado (Ingenuity Pathway Analysis™) y una herramienta de análisis funcional específica del feto desarrollada por colaboradores de la Universidad de Tufts (DFLAT).

Las transcripciones cerebrales más reguladas hacia arriba y hacia abajo se identificarán como biomarcadores candidatos de resultados anormales para futuros estudios de validación.

Los resultados del embarazo hasta las seis semanas posparto para la madre y el bebé se recopilarán del registro médico del hospital, incluidas las anomalías fetales detectadas en ultrasonido o resonancia magnética, gestación y modo de nacimiento, peso al nacer, uso de terapias prenatales (inmunoglobulina CMV u otra), investigaciones del recién nacido tales como resultados de análisis de orina/saliva/sangre de cordón umbilical, ecografía craneal, examen físico y resultados de pruebas de audición para recién nacidos.

Resultados esperados: en comparación con los fetos no infectados, los fetos infectados con CMV mostrarán vías de desarrollo neurológico y expresión génica alteradas en el análisis funcional. Las transcripciones específicas del cerebro fetal que se expresan diferencialmente en los fetos infectados con CMV se identificarán como biomarcadores candidatos del resultado del desarrollo neurológico para futuros estudios de validación.

Almacenamiento y seguridad de datos La base de datos se configurará dentro de RedCap (Research Electronic Data Capture), una aplicación gratuita, segura y basada en la web diseñada para respaldar la captura de datos de pacientes para estudios de investigación. El servicio REDCap de la Universidad de Melbourne proporciona almacenamiento seguro y políticas de respaldo que cumplen con los estándares de la Universidad y la Ley de privacidad e información de salud de los Estados Unidos. Solo los investigadores del estudio tendrán acceso a esta base de datos.

Las copias impresas de los formularios de consentimiento y otra información del estudio se guardarán en archivadores cerrados. Solo los investigadores del estudio y el HREC tendrán acceso a los archivos.

6.0 Criterios de inclusión Las mujeres que se sometan a una amniocentesis clínicamente indicada por sospecha de infección congénita por CMV a través del Departamento de Medicina Perinatal del Mercy Hospital for Women o del Royal Hospital for Women, Randwick serán identificadas a partir de las referencias clínicas perinatales del Dr. Hui o el Dr. Shand, respectivamente. Estas mujeres incluirán (i) mujeres con evidencia de infección materna primaria por CMV durante el embarazo (ii) Fetos con anomalías estructurales que sugieran una infección congénita por CMV (como se enumeran en Hui L y Wood G. Resultado perinatal después de la infección materna primaria por citomegalovirus en el primer trimestre: una actualización práctica y una ayuda de asesoramiento. 2015 Diagnóstico Prenatal; 35:1-7. ) Cualquier mujer de habla inglesa de 18 años o más que sea capaz de dar su consentimiento informado será elegible.

Los sujetos con infección fetal por CMV confirmada formarán el grupo de casos. Los fetos sin evidencia de infección congénita formarán el grupo de control. Los fetos estructuralmente anormales que son CMV negativos serán excluidos del análisis del grupo de control. La tasa de fetos infectados frente a no infectados después de la infección materna es de aproximadamente el 40 %, por lo que anticipamos una proporción razonable de casos y controles para nuestro tamaño de muestra objetivo.

El equipo clínico realizará el contacto inicial, pero se realizará un seguimiento por parte de una partera de investigación para discutir el estudio de investigación en detalle, ya sea por teléfono o en persona después de la consulta clínica siempre que sea posible. Esto es para minimizar los conflictos potenciales de que los médicos obtengan el consentimiento del paciente para el estudio. Se asegurará a los pacientes que no tendrán ninguna obligación de participar y que su decisión no afectará su atención clínica ni su relación con el médico tratante. Se obtendrá el consentimiento informado por escrito de las mujeres antes de su procedimiento y se almacenará en un archivo cerrado. gabinete en los respectivos Departamentos de Medicina Perinatal.

Criterios de exclusión Mujeres que no dan su consentimiento, que no son capaces de dar su consentimiento para procedimientos médicos, que no hablan inglés o que son menores de 18 años.

Análisis estadísticos Tamaño de la muestra En general, cuantas más réplicas biológicas (mayor tamaño de la muestra), más sólidas serán las inferencias que se pueden hacer a partir de los datos de expresión génica. La variación biológica entre las muestras y la expansión esperada de la expresión génica diferencial son factores importantes que influyen en el tamaño ideal de la muestra. Para este estudio, los investigadores no saben de antemano cómo se distribuirán los niveles de expresión génica, lo que restringe nuestra capacidad de usar algoritmos de tamaño de muestra para experimentos de RNA-seq. Además de las restricciones sobre la disponibilidad de muestras discutidas anteriormente, los altos costos asociados con el procesamiento de laboratorio limitaron la viabilidad de usar un gran número de muestras de AF.

Los principales factores que influyen en los cálculos formales del tamaño de la muestra para los experimentos de secuenciación de ARN son: la profundidad de la secuenciación, el coeficiente de variación, la magnitud de la expresión diferencial detectada, la tasa de falsos positivos y la potencia. Suponiendo una profundidad de lectura promedio de 20, un coeficiente de variación igual dentro del grupo de 0,4, un tamaño del efecto de 2 veces, una tasa de falsos positivos de 0,05 y una potencia del 80 %, el número de sujetos por grupo requerido es 7,1. Por lo tanto, los investigadores apuntan a un objetivo mínimo de diez muestras por grupo.

Análisis de expresión génica diferencial y análisis funcional Un consultor especialista en bioinformática dentro del Translational Obstetric Group estará disponible para apoyo estadístico y de análisis de los datos de expresión génica. Se identificarán los genes que están significativamente desregulados en los casos infectados por CMV en comparación con los controles no infectados. Los análisis funcionales de los genes expresados ​​diferencialmente se realizarán usando el software Ingenuity Pathways Analysis (IPA) Versión 9.0 (Ingenuity; Redwood City, CA). Ingenuity es una base de datos seleccionada manualmente que identifica los procesos biológicos sobrerrepresentados en un conjunto de datos determinado y calcula una puntuación significativa para cada resultado utilizando la prueba de Fisher de cola derecha. Los investigadores también utilizarán una anotación funcional específica del feto disponible públicamente "Developmental FunctionaL Annotation at Tufts" (DFLAT) que se ha demostrado previamente que mejora la interpretación biológica de los conjuntos de datos perinatales (http://dflat.cs.tufts.edu).2