DNA複製ダイナミクスに対するアデノウイルスE1A癌遺伝子の影響

バックグラウンド：

TThe 243 アミノ酸 E1A タンパク質 (E1A タンパク質を変換する小さな E1A タンパク質としても知られている) は、ヒトアデノウイルス (Ad) 2 型または 5 型ゲノムの左端によってコードされており、モデル協力腫瘍タンパク質、アポトーシスなど、さまざまな状況で研究されています。タンパク質を誘導し、治療用腫瘍溶解タンパク質として。 これらの特性はすべて、さまざまな細胞で S 期を急速に誘導する能力に関連しています。 E1A は、Rb ファミリータンパク質、HAT タンパク質 p300 および CBP を含む一連のクロマチンリモデリング複合体と相互作用することにより、これらの効果のほとんどを調整します。

E1A-Rb-HDAC 相互作用による E2F の誘導は十分に文書化されていますが、細胞周期の進行における E1A-p300/CBP 相互作用の結果は明らかではありません。 以前の研究では、p300/CBP は、p300、YY1、HDAC3 からなる三者リプレッサー複合体を介して c-Myc 転写を抑制することにより、静止細胞の S 期への早期移行を防ぐことが実証されました。 E1A は p300 に結合し、リプレッサー複合体を解離して S 期を誘導します。 このメカニズムによる c-Myc の誘導は、ゲノムの不安定性につながる DNA 損傷応答と異常な細胞 DNA 複製の誘導に寄与します。 最近発表された研究では、E1A が極めて重要な DNA 複製開始因子 Cdt1 を高レベルに誘導し、その結果、複製起点活性が増加し、S 期後期に DNA 損傷応答と細胞 DNA 再複製が誘導されることが示されました。 単一分子 DNA ファイバー アッセイを使用して、E1A が DNA 複製のダイナミクスに大きな変化を誘発し、起点の活性化に全体的な変化を誘発するように見えることが発見されました。

Cdt1 は極めて重要な DNA 複製開始因子であり、そのレベルは細胞周期の進行中に振動します。 G1後期に、そのレベルが上昇してDNA複製が開始されます。 S 期の開始時に、E3 リガーゼによって速やかに分解されるため、一度発火した起点は S 期で再び発火せず、1 細胞周期内での再複製は起こりません。 E3 リガーゼによる S 期の Cdt1 の分解障害は、細胞 DNA が再複製を受ける主要なメカニズムです。 E1A 発現細胞では Cdt1 レベルが S 期に高いままであることが発見され、Cdt1 の非効率的な分解が示唆され、研究者が後期 S 期に観察した細胞 DNA の広範な再複製に寄与する可能性があります。

Myst ファミリー タンパク質 HBO1 (Myst2、KAT7) は、複製の開始に重要な役割を果たし、DNA の再複製にも寄与するヒストン アセチル トランスフェラーゼです。 HBO1 は Cdt1 と直接相互作用し、複製開始における Cdt1 のコアクチベーターとして機能します。 また、複製起点と関連し、H4 K5、K8、および K12 をアセチル化することによって起点の活性化を刺激します。 HBO1 の過剰発現は、DNA の再複製を誘導します。 起点での H4 ヒストンのアセチル化を含むクロマチン修飾の濃縮は、起点の活性化に強く影響します。 したがって、多数の血清刺激増殖シグナルが存在しない場合、E1Aは、いくつかの代償メカニズムを使用して細胞を強制的にS期に入れます。 制御されていない細胞 DNA 複製プログラムは、がんの特徴である倍数性を引き起こします。 E1A などのウイルスの癌遺伝子が細胞の DNA 複製プログラムを変更することは興味深いことです。 これは、ウイルスの癌遺伝子によって誘発される複製ストレスのメカニズムに関連する多くの重要な問題を提起します。 たとえば、E1A はどのように DNA の再複製を誘導するのでしょうか? HBO1のE1A刺激は開始メカニズムを変化させ、起点でのHBO1媒介クロマチン修飾が再複製を促進するかどうか?

研究の具体的な目的:

私たちの具体的な目的は、E1A による HBO1 活性の刺激が、規制緩和された DNA 複製に関与しているかどうかを判断することです。

1. 標準的なアッセイを使用して、研究者は E1A が HBO1 に結合して HAT 活性を誘導するかどうかを判断します。
2. 研究者は、一過性およびウイルス感染アッセイを使用して、E1A による HBO1 HAT 活性の刺激が複製前複合体 (Pre-RC) 形成を促進するかどうか、および E1A が HAT 活性を定性的および定量的に変化させるかどうかを判断します。
3. 研究者は、HBO1 の HAT 活性の E1A 刺激が DNA 再複製に寄与するかどうかを判断します。

研究計画と方法:

この研究の目的は、E1A による HBO1 HAT 活性の刺激が (i) 開始を促進するかどうか、(ii) 起点領域での H4 K5、K8 および K12 のアセチル化の質的および量的変化を誘発するかどうか、および (iii) 再活性化を促進するかどうかを判断することです。 E1A+細胞で起こる複製。 HAT 活性の増加がこれらの機能の 1 つまたは複数を刺激できる場合、E1A のこの特性が異常な DNA 複製の誘導にどのように寄与するかを説明できます。

1. WTおよびHAT欠損HBO1へのE1A結合。

   研究者はまず、GST 結合と in vivo co-IP 実験を行うことにより、E1A が HBO1 に直接結合するかどうかを判断します。 結合が確認された場合、研究者は両方のタンパク質の結合部位をマッピングします。 研究者は、相互作用を無効にする両方のタンパク質の変異体を分離します。 すべての E1A 変異体は、Rb および p300 との相互作用について評価され、これらのタンパク質に結合する能力を保持している変異体のみが使用されます。 E1A 結合能力を保持しているが、HAT 活性を欠いている HBO1 変異体を分離する必要があります。 これらの研究では、広く使用されている HAT 欠損変異体 G435A が使用されます。 E1A がこの変異体に結合する場合、E1A によって誘導される HAT 活性が複製開始の刺激に重要であることを確認する価値のある変異体になります。 この HBO1 変異体が E1A に結合しない場合、E1A 結合能力を保持しているが HAT 活性を欠いている新しい HBO1 変異体を分離することが重要になります。

2. 起点活性化におけるE1A誘導HBO1 HAT活性の役割:

   まず、調査員は、E1A が複製起点と関連付けられているかどうか、およびこの関連付けに HBO1 が必要かどうかを判断します。研究者は、PRKDC と (プロテインキナーゼ、DNA 活性化、触媒ポリペプチド) および MCM4 遺伝子の間の遺伝子間領域にマッピングされる MCM4 起源を使用します。 まず、研究者は関連タンパク質を発現するプラスミドで U2OS 細胞をトランスフェクトし、ChIP アッセイを使用して起点配列の占有率を決定します。 エピトープタグ付きWT HBO1または変異誘導体を発現するプラスミドを、WTまたは変異E1Aタンパク質を発現するプラスミドとともにU2OS細胞で発現させ、その後、起点領域におけるこれらのタンパク質の占有率を、必要に応じて抗体を使用して定量化します。 通常、これらの実験では、関連する抗体を使用して、起点領域と起点から離れた領域を含むプライマー ペアを使用して ChIP アッセイを実行します。 開始因子の占有率は、2KB の上流または下流領域と比較して、起点領域で数倍増加します。 Cdt1 と一緒に MCM 複合体を起点にロードすることは、複製の開始がその起点で発生し、通常は次のように ChIP-re-ChIP アッセイでアッセイされることを示しています。まず、起点への HBO1 のロードは、最初のチップ。 抗HBO1沈殿物は、抗MCM3抗体で再ChIPされます。 オリジンへの MCM3 ヘリカーゼのロードは、Cdt1 結合後に発生し、HBO1 HAT アクティビティに依存します。 E1A+コントロールサンプルでの再ChIP後、正常量のMCM3が検出されます。 変異体E1AまたはHBO1変異体（例： HBO1 G435A) を使用すると、E1A による HAT 活性の刺激が、E1A+ 細胞における最大の起点活性にとって重要であることを示します。 他の人によってうまく使用されているこのタイプのアッセイは、変異タンパク質を迅速にアッセイできるという点でかなりの柔軟性があります。 この ChIP-reChiP アッセイは、E1A 負荷を決定するためにさまざまな組み合わせで繰り返されます。

   これらの結果は、ウイルス感染アッセイに拡張されます。 薬物処理によって分離された G1 特異的細胞は、必要に応じてエピトープタグ付きタンパク質を発現する Ad ベクターに感染します。 E1A と HBO1 およびそれらの変異誘導体の関連性が決定されます。 このアッセイにより、HBO1 の HAT 活性を増加させる以外に、原点発火における E1A 刺激 HAT 活性の効果を確認し、原点発火に対する E1A の影響を研究することができます。 たとえば、E1A による c-Myc の誘導には HAT 活性は関与しません。

3. H4、K5、K8、および K12 のアセチル化における E1A 誘導 HBO1 HAT 活性の影響。

   これを評価するために、研究者は、ウイルス感染細胞から調製したクロマチンを、HBO1 の起点ローディングを検出するために、適切な起点特異的プライマーおよびエピトープ特異的抗体で ChIP します。研究者は、K5、K8、および K12 アセチル化を検出するために、抗 H4 テトラ Ac 抗体を使用して ChIP 沈殿物を再チップします。 E1A および HBO1 を発現する細胞では、HBO1 ウイルスのみに感染した細胞と比較して、H4 アセチル化が大幅に増加します。 使用する変異体によっては、H4 アセチル化が影響を受ける場合があります。

4. E1A は、再複製において HBO1 HAT 活性を刺激しました。

   HBO1 の過剰発現は、DNA 複製を誘導することが示されています。 E1A が HBO1 HAT 活性を刺激することによって再複製を誘導する際に HBO1 を使用するかどうかを判断するために、研究者は S 期濃縮細胞 (二重チミジン ブロックによって分離された) を、HBO1 バリアントを発現する Ad ベクターと共に WT または変異体 E1A タンパク質を発現する Ad ウイルスに感染させます。 （例えば。 HAT 非アクティブ)、必要に応じて感染を進行させ、フローサイトメーターを使用して >4N DNA 含有量を含む細胞の集団を定量化します。 E1A シミュレートされた HBO1 HAT 活性が再複製に重要である場合、HAT 欠損 HBO1 変異体は、E1A の存在下でも再複製を誘導しません。 HBO1 に結合できない E1A 変異体も同様の表現型を示します。

5. 再複製起点における H4 アセチル化に対する E1A の影響:

   再複製起点での H4 アセチル化を研究するために、研究者は、後期 S 期に E1A+ 細胞で再複製を受ける細胞起点を知る必要があります。 研究者は、再複製を含む E1A+ 細胞で活性化された起点を特定することを計画しています。 調査員が 1 つまたは 2 つの再複製起点を特定すると、調査員は、エピトープタグ付き WT および変異体 HBO1 対立遺伝子および E1A を発現する細胞でこれらの起点を使用してアセチル化を定量化します。研究者は、E1A による H4 アセチル化の質的または量的 (またはその両方) を予想しています。

6. 期待される結果と落とし穴:

提案されたすべての実験の最後に、研究者は、E1A による HBO1 HAT 活性の刺激が E1A+ 細胞の起点活性化に重要であるかどうか、および E1A 誘導 HAT 活性が再複製に役割を果たしているかどうかを判断することを期待しています。 研究者は、関連する試薬の入手など、技術的またはその他の問題を予期していません。