Az adenovírus E1A onkogén hatása a DNS-replikációs dinamikára

HÁTTÉR:

A 243 aminosavból álló E1A fehérjét (más néven kis E1A fehérjét, transzformáló E1A fehérjét), amelyet a humán adenovírus (Ad) 2-es vagy 5-ös típusú genomjának bal vége kódol, különböző összefüggésekben tanulmányozták, beleértve az együttműködő onkoproteint, az apoptózist. fehérjét indukáló, valamint terápiás onkolitikus fehérjeként. Mindezek a tulajdonságok azzal a képességgel függnek össze, hogy gyorsan indukálja az S fázist számos sejtben. Az E1A ezeknek a hatásoknak a többségét úgy hangolja össze, hogy kölcsönhatásba lép egy sor kromatin-remodelling komplexszel, beleértve az Rb család fehérjéit, valamint a p300 és CBP HAT fehérjéket.

Az E2F E1A-Rb-HDAC kölcsönhatások általi indukálása jól dokumentált, míg az E1A-p300/CBP kölcsönhatások sejtciklus-progresszióra gyakorolt ​​következményei nem egyértelműek. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a p300/CBP megakadályozza a nyugvó sejtek korai bejutását az S-fázisba azáltal, hogy elnyomja a c-Myc transzkripciót egy háromoldalú represszor komplexen keresztül, amely p300, YY1, HDAC3 komponensekből áll. Az E1A a p300-hoz kötődik, és disszociálja a represszor komplexet, hogy S fázist indukáljon. A c-Myc ezzel a mechanizmussal történő indukálása hozzájárul a DNS-károsodási válasz indukálásához és a rendellenes sejtes DNS-replikációhoz, ami genomiális instabilitáshoz vezet. Egy nemrégiben publikált tanulmány kimutatta, hogy az E1A magas szintre indukálja a kulcsfontosságú DNS-replikációs iniciációs faktort, a Cdt1-et, ami megnövekedett replikációs origó-aktivitást és késői S-fázisban, DNS-károsodási válasz indukálását és sejtes DNS-replikációt eredményez. Az egymolekulájú DNS-rost assay segítségével felfedezték, hogy az E1A jelentős változásokat indukál a DNS-replikáció dinamikájában, és úgy tűnik, hogy globális változásokat indukál az eredet aktiválásában.

A Cdt1 egy kulcsfontosságú DNS-replikáció iniciációs faktor, amelynek szintjei ingadoznak a sejtciklus progressziója során. A késői G1-ben szintje megemelkedik, és elindítja a DNS-replikációt. Az S-fázis elején az E3 ligáz azonnal lebontja, így az egyszer már elindított origók nem tüzelnek újra az S-fázisban, és egyetlen sejtcikluson belül nem történik újrareplikáció. Az S-fázisban lévő Cdt1 károsodott lebontása az E3 ligáz által a fő mechanizmus, amellyel a sejtes DNS újrareplikáción megy keresztül. Felfedezték, hogy az E1A-t expresszáló sejtekben a Cdt1 szintje magas marad az S fázisban, ami a Cdt1 nem hatékony lebomlására utal, ami hozzájárulhat a sejtes DNS kiterjedt replikációjához, amit a kutatók a késői S fázisban figyeltek meg.

A Myst család HBO1 fehérje (Myst2, KAT7) egy hiszton-acetil-transzferáz, amely nagy szerepet játszik a replikáció iniciálásában, és hozzájárul a DNS újrareplikációjához is. A HBO1 közvetlenül kölcsönhatásba lép a Cdt1-gyel, és a Cdt1 koaktivátoraként működik a replikáció iniciációjában. A replikációs origóval is társul, és a H4 K5, K8 és K12 acetilezésével serkenti az origó aktiválását. A HBO1 túlzott expressziója DNS-replikációt indukál. A kromatin módosítások feldúsulása, beleértve a H4 hisztonok acetilezését az origónál, erősen befolyásolja az origó aktiválását. Így az E1A a szérum által stimulált proliferációs jelek sokaságának hiányában számos kompenzációs mechanizmus segítségével kényszeríti a sejteket az S fázisba való belépésre. A kontrollálatlan sejt-DNS-replikációs program poliploidiát okoz, amely a rák jellemzője. Izgalmas, hogy egy vírus onkogén, például az E1A megváltoztatja a sejt DNS-replikációs programot. Ez számos fontos kérdést vet fel a vírus onkogén által kiváltott replikációs stressz mechanizmusával kapcsolatban. Például hogyan indukálja az E1A a DNS-replikációt? Megváltoztatja-e az HBO1 E1A stimulációja az iniciációs mechanizmust, és hogy a HBO1 által közvetített kromatin módosulások az origónál elősegítik-e az újrareplikációt?

A VIZSGÁLAT KONKRÉT CÉLJA:

Konkrét célunk annak meghatározása, hogy a HBO1 aktivitás E1A általi stimulálása szerepet játszik-e a deregulált DNS-replikációban, és ha igen, akkor meghatározzuk a mechanizmust.

1. Szabványos vizsgálatok segítségével a kutatók meghatározzák, hogy az E1A kötődik-e az HBO1-hez, hogy kiváltsa annak HAT-aktivitását.
2. Tranziens és vírusfertőzési tesztek segítségével a kutatók megállapítják, hogy a HBO1 HAT aktivitásának E1A-val történő stimulálása fokozza-e a replikációs komplex (Pre-RC) képződését, és hogy az E1A által kiváltott HAT aktivitás minőségileg és mennyiségileg megváltoztatja-e a H4 acetilációt a kiindulási régiókban.
3. a kutatók meg fogják határozni, hogy a HBO1 HAT aktivitásának E1A stimulálása hozzájárul-e a DNS újrareplikációjához.

A KUTATÁS TERVEZÉSE ÉS MÓDSZEREI:

A vizsgálat célja annak meghatározása, hogy a HBO1 HAT aktivitásának E1A általi stimulálása (i) fokozza-e az iniciációt (ii) minőségi és mennyiségi változásokat indukál-e a H4 K5, K8 és K12 acetilációjában a kiindulási régióban, és (iii) fokozza-e a re- replikáció, amely az E1A+ sejtekben történik. Ha a megnövekedett HAT-aktivitás egy vagy több funkciót stimulálhat, ez megmagyarázhatja, hogy az E1A ezen tulajdonsága hogyan járul hozzá a rendellenes DNS-replikáció kiváltásához.

1. E1A kötődik WT- és HAT-hiányos HBO1-hez.

   a kutatók először a GST kötődési és in vivo ko-IP kísérletek elvégzésével meghatározzák, hogy az E1A közvetlenül kötődik-e az HBO1-hez. Ha a kötődés megerősítést nyer, a vizsgálók mindkét fehérjén feltérképezik a kötőhelyeket. a kutatók ezután mindkét fehérje mutánsait izolálják, amelyek megszüntetik a kölcsönhatásokat. Minden E1A mutánst értékelni kell az Rb-vel és a p300-zal való kölcsönhatása szempontjából, és csak azokat a mutánsokat használjuk, amelyek megőrzik kötődési képességüket ezekhez a fehérjékhez. Szükség lesz egy olyan HBO1 mutáns izolálására, amely megtartja az E1A kötőképességét, de hiányzik a HAT aktivitása. Ezekben a vizsgálatokban egy széles körben használt HAT-hiányos G435A mutánst használnak majd. Ha az E1A kötődik ehhez a mutánshoz, akkor ez egy értékes mutáns annak megerősítésére, hogy az E1A által indukált HAT aktivitás kritikus fontosságú a replikáció iniciációjának stimulálásában. Ha ez a HBO1-mutáns nem kötődik E1A-hoz, fontos lesz olyan új HBO1-mutánsok izolálása, amelyek megtartják az E1A-kötő képességet, de nem rendelkeznek HAT-aktivitással.

2. Az E1A által kiváltott HBO1 HAT aktivitás szerepe az eredet aktiválásában:

   Először is, a kutatók megállapítják, hogy az E1A kapcsolódik-e a replikációs origókhoz, és hogy ehhez az asszociációhoz szükség van-e HBO1-re. a kutatók az MCM4 origót fogják használni, amely a PRKDC és a (protein kináz, DNS-aktivált, katalitikus polipeptid) és az MCM4 gének közötti intergenikus régióban térképeződik fel. Először is, a kutatók U2OS sejteket transzfektálnak releváns fehérjéket expresszáló plazmidokkal, majd ChIP-vizsgálatok segítségével meghatározzák az eredeti szekvenciákban való elfoglaltságukat. Az epitóppal jelölt WT HBO1 vagy mutáns származékokat expresszáló plazmidok, valamint a WT vagy mutáns E1A fehérjéket expresszáló plazmidok U2OS sejtekben expresszálódnak, majd ezeknek a fehérjéknek az eredetrégióin való elfoglaltságát mennyiségileg meghatározzuk, megfelelő antitestek felhasználásával. Jellemzően ezekben a kísérletekben, releváns antitestek felhasználásával, ChIP vizsgálatokat végeznek olyan primer párokkal, amelyek magukban foglalják a származási régiókat és az eredettől távol eső régiókat is. Az iniciációs faktorok foglaltsága többszörösére nő a kiindulási régióban, összehasonlítva a 2 KB-os upstream vagy downstream régiókkal. Az MCM-komplex és a Cdt1-nek az origóba való betöltése azt jelzi, hogy a replikáció beindulása abban az origóban történik, és általában a ChIP-re-ChIP vizsgálatokban a következőképpen vizsgálják: Először is, a HBO1-nek az origóba való betöltését epitóp-specifikus antitestek segítségével kell megerősíteni. az első ChIP. Az anti-HBO1 csapadékot anti-MCM3 antitestekkel újrachipáljuk. Az MCM3 helikáz origóba való betöltése a Cdt1 kötődése után következik be, és a HBO1 HAT aktivitásától függ. Az E1A+ kontrollmintákban az MCM3 normál mennyisége lesz kimutatható az újbóli ChIP-kezelés után. Ha csökkentett mennyiségű MCM3 nyerhető vissza a reChIP vizsgálatok során, amikor mutáns E1A vagy HBO1 mutáns (pl. A HBO1 G435A) alkalmazása azt jelzi, hogy a HAT aktivitás E1A általi stimulálása kritikus fontosságú az E1A+ sejtekben a maximális eredetaktivitás szempontjából. Az ilyen típusú, mások által sikeresen alkalmazott vizsgálati eljárások jelentős rugalmassággal rendelkeznek, mivel a mutáns fehérjéket gyorsan lehet vizsgálni. Ez a ChIP-reChiP vizsgálat különböző kombinációkban megismétlődik az E1A terhelés meghatározására.

   Ezeket az eredményeket kiterjesztik a vírusfertőzési vizsgálatokra is. A gyógyszeres kezeléssel izolált G1-specifikus sejteket megfelelő módon epitóppal jelölt fehérjéket expresszáló Ad vektorokkal fertőzzük meg. Meghatározzuk az E1A és HBO1 kapcsolatát, valamint mutáns származékaikat. Ez a vizsgálat lehetővé teszi számunkra, hogy megerősítsük az E1A által stimulált HAT-aktivitás hatását a származási tüzelésben, és tanulmányozzuk az E1A hatását az eredet-tüzelésre, ha van ilyen, kivéve az HBO1 HAT-aktivitásának növelését. Például az E1A általi c-Myc indukció nem jár HAT aktivitással.

3. Az E1A által kiváltott HBO1 HAT aktivitás hatása a H4, K5, K8 és K12 acetilezésében.

   Ennek értékelésére a kutatók a vírussal fertőzött sejtekből előállított kromatint az eredet-specifikus primerekkel és epitóp-specifikus antitestekkel ChIP-ként kezelik a HBO1 eredet-terhelésének kimutatására. a nyomozók ezután újra feldarabolják a ChIP csapadékot anti-H4 tetra-Ac antitestek segítségével a K5, K8 és K12 acetiláció kimutatására. Az E1A-t és HBO1-et expresszáló sejtekben a H4-acetiláció jelentősen megnövekszik, összehasonlítva az egyedül HBO1-vírussal fertőzött sejtekkel. A használt mutánsoktól függően a H4-acetilezés befolyásolható.

4. Az E1A serkentette a HBO1 HAT aktivitást az újrareplikációban.

   Kimutatták, hogy a HBO1 túlzott expressziója DNS-replikációt indukál. Annak megállapítására, hogy az E1A felhasználja-e a HBO1-et az újrareplikáció indukálására a HBO1 HAT aktivitás stimulálásával, a kutatók megfertőzik az S-fázisban dúsított sejteket (kettős timidin blokkal izolált) a WT vagy mutáns E1A fehérjéket expresszáló Ad vírusokkal, valamint a HBO1 variánsokat expresszáló Ad vektorokkal. (például. HAT inaktív), hagyja, hogy a fertőzés szükség szerint folytatódjon, majd áramlási citométerrel számszerűsítse a >4N DNS-tartalmú sejtpopulációt. Ha az E1A szimulált HBO1 HAT aktivitása fontos az újrareplikációhoz, a HAT hibás HBO1 mutánsok még E1A jelenlétében sem indukálják az újrareplikációt. Azok az E1A mutánsok, amelyek nem tudnak kötődni az HBO1-hez, szintén hasonló fenotípust mutatnak.

5. Az E1A hatása a H4 acetilációra a replikációs eredetben:

   Annak érdekében, hogy a H4 acetilációit a replikációs origókban tanulmányozhassák, a kutatóknak tudniuk kell, hogy melyik sejtes eredet replikálódik újra E1A+ sejtekben a késői S fázisban. a kutatók azt tervezik, hogy azonosítsák az E1A+ sejtekben aktivált eredeteket, beleértve azokat is, amelyek újrareplikálódnak. Amint a vizsgálók azonosítanak egy vagy két ismétlődő replikációs origót, a kutatók számszerűsítik az acetilációt ezen origók felhasználásával az epitóppal jelölt WT és mutáns HBO1 allélokat és E1A-t expresszáló sejtekben. a vizsgálók kvalitatív vagy kvantitatív (vagy mindkettő) E1A miatti H4 acetilációra számítanak.

6. Várható eredmények és buktatók:

Az összes javasolt kísérlet végén a kutatók azt várják, hogy megállapítsák, hogy a HBO1 HAT aktivitásának E1A általi stimulálása kritikus fontosságú-e az E1A+ sejtekben az originaktiváció szempontjából, és hogy az E1A által indukált HAT aktivitásnak van-e szerepe az újrareplikációban. A vizsgálók nem számítanak semmilyen műszaki vagy egyéb problémára, beleértve a megfelelő reagensek beszerzését.