Влияние онкогена аденовируса Е1А на динамику репликации ДНК

ФОН:

Белок E1A из 243 аминокислот (также известный как малый белок E1A, трансформирующий белок E1A), кодируемый левым концом генома аденовируса человека (Ad) типа 2 или 5, был изучен в различных контекстах, в том числе в качестве модели, взаимодействующей с онкобелком, апоптозом. индуцирующий белок, и как терапевтический онколитический белок. Все эти свойства связаны с его способностью быстро индуцировать S-фазу в различных клетках. E1A управляет большинством этих эффектов, взаимодействуя с набором комплексов ремоделирования хроматина, включая белки семейства Rb и белки HAT p300 и CBP.

Индукция E2F взаимодействиями E1A-Rb-HDAC хорошо задокументирована, тогда как последствия взаимодействий E1A-p300/CBP в развитии клеточного цикла не ясны. Предыдущие исследования продемонстрировали, что p300/CBP предотвращает преждевременное вступление покоящихся клеток в S-фазу путем репрессии транскрипции c-Myc посредством трехчастного репрессорного комплекса, состоящего из p300, YY1, HDAC3. Е1А связывается с р300 и диссоциирует репрессорный комплекс, индуцируя S-фазу. Индукция c-Myc по этому механизму способствует индукции реакции на повреждение ДНК и аберрантной репликации клеточной ДНК, что приводит к нестабильности генома. В недавно опубликованном исследовании было показано, что E1A индуцирует ключевой фактор инициации репликации ДНК Cdt1 до высоких уровней, что приводит к увеличению активности источника репликации, а в поздней S-фазе - к индукции ответа на повреждение ДНК и повторной репликации клеточной ДНК. С помощью анализа волокон ДНК с одной молекулой было обнаружено, что E1A вызывает значительные изменения в динамике репликации ДНК и, по-видимому, вызывает глобальные изменения в активации ориджина.

Cdt1 является основным фактором инициации репликации ДНК, уровни которого колеблются в ходе прогрессии клеточного цикла. В конце G1 его уровни повышаются, чтобы инициировать репликацию ДНК. В начале S-фазы он быстро расщепляется лигазой E3, так что ориджины, которые уже активировались один раз, не активируются снова в S-фазе, и повторная репликация в пределах одного клеточного цикла не происходит. Нарушенная деградация Cdt1 в S-фазе лигазой E3 является основным механизмом повторной репликации клеточной ДНК. Было обнаружено, что в клетках, экспрессирующих E1A, уровни Cdt1 остаются высокими в S-фазе, что указывает на неэффективную деградацию Cdt1, которая может способствовать обширной повторной репликации клеточной ДНК, которую исследователи наблюдали в поздней S-фазе.

Белок семейства Myst HBO1 (Myst2, KAT7) представляет собой гистон-ацетилтрансферазу, которая играет важную роль в инициации репликации, а также способствует повторной репликации ДНК. HBO1 напрямую взаимодействует с Cdt1 и действует как коактиватор Cdt1 при инициации репликации. Он также связывается с началом репликации и стимулирует активацию начала за счет ацетилирования H4, K5, K8 и K12. Сверхэкспрессия HBO1 вызывает повторную репликацию ДНК. Обогащение модификаций хроматина, включая ацетилирование гистонов H4 в ориджине, сильно влияет на активацию ориджина. Таким образом, E1A в отсутствие множества стимулируемых сывороткой сигналов пролиферации заставляет клетки входить в S-фазу, используя несколько компенсаторных механизмов. Неконтролируемая программа репликации клеточной ДНК вызывает полиплоидию, которая является отличительной чертой рака. Удивительно, что вирусный онкоген, такой как E1A, изменяет программу репликации клеточной ДНК. Это поднимает ряд важных вопросов, связанных с механизмом стресса репликации, индуцируемого вирусным онкогеном. Например, как E1A индуцирует повторную репликацию ДНК? Изменяет ли стимуляция E1A HBO1 механизм инициации и способствуют ли модификации хроматина в истоках, опосредованные HBO1, повторной репликации?

КОНКРЕТНАЯ ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Наша конкретная цель состоит в том, чтобы определить, играет ли стимуляция активности HBO1 с помощью E1A роль в дерегулированной репликации ДНК, и если да, то определить механизм.

1. Используя стандартные анализы, исследователи определят, связывается ли E1A с HBO1, чтобы вызвать его HAT-активность.
2. Используя анализы временной и вирусной инфекции, исследователи определят, усиливает ли стимуляция активности HBO1 HAT с помощью E1A образование пререпликативного комплекса (Pre-RC) и изменяет ли HAT-активность, индуцированная E1A, качественно и количественно ацетилирование H4 в областях происхождения.
3. исследователи определят, способствует ли стимуляция E1A HAT-активности HBO1 повторной репликации ДНК.

ДИЗАЙН И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Целью данного исследования является определение того, усиливает ли стимуляция активности HBO1 HAT с помощью E1A (i) усиление инициации (ii) вызывает качественные и количественные изменения в ацетилировании H4 K5, K8 и K12 в исходной области и (iii) усиливает ре- репликация, происходящая в клетках E1A+. Если повышенная активность HAT может стимулировать одну или несколько из этих функций, это может объяснить, как это свойство E1A будет способствовать индукции аберрантной репликации ДНК.

1. Связывание E1A с HBO1 с дефицитом WT и HAT.

   исследователи сначала определят, связывается ли E1A напрямую с HBO1, выполнив эксперименты по связыванию GST и co-IP in vivo. Если связывание подтвердится, исследователи нанесут на карту сайты связывания на обоих белках. затем исследователи изолируют мутанты обоих белков, которые устраняют взаимодействие. Все мутанты E1A будут оцениваться на предмет их взаимодействия с Rb и p300, и будут использоваться только мутанты, которые сохраняют свою способность связываться с этими белками. Будет необходимо выделить мутант HBO1, который сохраняет способность связывания E1A, но не имеет HAT-активности. В этих исследованиях будет использоваться широко используемый дефицитный по HAT мутант G435A. Если E1A связывается с этим мутантом, это будет ценный мутант для подтверждения того, что HAT-активность, индуцированная E1A, имеет решающее значение для стимуляции инициации репликации. Если этот мутант HBO1 не связывается с E1A, будет важно выделить новые мутанты HBO1, которые сохраняют способность связывания E1A, но не обладают HAT-активностью.

2. Роль E1A-индуцируемой активности HBO1 HAT в активации происхождения:

   Во-первых, исследователи определят, ассоциирован ли E1A с источниками репликации и требует ли эта ассоциация HBO1. исследователи будут использовать происхождение MCM4, которое картируется в межгенной области между PRKDC и (протеинкиназа, ДНК-активированный, каталитический полипептид) и генами MCM4. Во-первых, исследователи трансфицируют клетки U2OS плазмидами, экспрессирующими соответствующие белки, а затем определяют их занятость в исходных последовательностях с помощью анализов ChIP. Плазмиды, экспрессирующие помеченный эпитопом WT HBO1 или мутантные производные, наряду с плазмидами, экспрессирующими WT или мутантные белки E1A, будут экспрессироваться в клетках U2OS, затем количество этих белков в исходных областях будет количественно определено с использованием соответствующих антител. Обычно в этих экспериментах с использованием соответствующих антител анализы ChIP проводят с парами праймеров, охватывающими области происхождения, а также области, которые далеки от происхождения. Занятость факторов инициации увеличивается в несколько раз в области происхождения по сравнению с областями 2 КБ выше или ниже по течению. Загрузка комплекса MCM вместе с Cdt1 в ориджин является признаком того, что инициация репликации происходит в этом ориджине и обычно анализируется в анализах ChIP-re-ChIP следующим образом: первый ЧИП. Преципитаты анти-HBO1 будут повторно чипированы антителами против MCM3. Загрузка хеликазы MCM3 в ориджины происходит после связывания Cdt1 и зависит от активности HBO1 HAT. Нормальное количество MCM3 будет обнаружено после повторного чипирования в контрольных образцах E1A+. Если уменьшенное количество MCM3 восстанавливается в анализах reChIP, когда мутантный E1A или мутантный HBO1 (например, HBO1 G435A), это указывает на то, что стимуляция HAT-активности с помощью E1A имеет решающее значение для максимальной исходной активности в клетках E1A+. Этот тип анализа, который был успешно использован другими, обладает значительной гибкостью, поскольку мутантные белки можно быстро анализировать. Эти анализы ChIP-reChiP будут повторяться в различных комбинациях для определения нагрузки E1A.

   Эти результаты будут распространены на тесты на вирусную инфекцию. Специфичные для G1 клетки, выделенные с помощью лекарственного лечения, будут инфицированы Ad-векторами, экспрессирующими белки, меченные эпитопом, в зависимости от ситуации. Будет определена ассоциация E1A и HBO1 и их мутантных производных. Этот анализ позволит нам подтвердить влияние стимулированной E1A HAT-активности на возбуждение происхождения и изучить влияние E1A на возбуждение происхождения, если таковое имеется, кроме повышения HAT-активности HBO1. Например, индукция c-Myc с помощью E1A не связана с HAT-активностью.

3. Эффекты E1A индуцировали активность HBO1 HAT в ацетилировании H4, K5, K8 и K12.

   Чтобы оценить это, исследователи будут чипировать хроматин, полученный из инфицированных вирусом клеток, с помощью специфичных к происхождению праймеров и антител, специфичных к эпитопу, в зависимости от ситуации, чтобы определить исходную загрузку HBO1. Затем исследователи повторно чипируют преципитаты ChIP, используя антитела против тетра-Ac H4 для обнаружения ацетилирования K5, K8 и K12. В клетках, экспрессирующих E1A и HBO1, ацетилирование H4 будет значительно повышено по сравнению с клетками, инфицированными только вирусом HBO1. Ацетилирование H4 может быть нарушено в зависимости от используемых мутантов.

4. E1A стимулировал активность HBO1 HAT при повторной репликации.

   Было показано, что сверхэкспрессия HBO1 вызывает репликацию ДНК. Чтобы определить, использует ли E1A HBO1 для индукции повторной репликации путем стимуляции HAT-активности HBO1, исследователи будут инфицировать клетки, обогащенные S-фазой (изолированные с помощью двойного тимидинового блока), вирусами Ad, экспрессирующими белки WT или мутантные белки E1A, вместе с векторами Ad, экспрессирующими варианты HBO1. (например. HAT неактивен), позволяют инфекции развиваться по мере необходимости, затем количественно определяют популяцию клеток, содержащих> 4N ДНК, с помощью проточного цитометра. Если HAT-активность, смоделированная E1A, HBO1 важна для повторной репликации, HAT-дефектные мутанты HBO1 не будут индуцировать повторную репликацию даже в присутствии E1A. Мутанты E1A, которые не могут связываться с HBO1, также будут демонстрировать аналогичный фенотип.

5. Влияние E1A на ацетилирование H4 в ререплицирующихся источниках:

   Чтобы изучить ацетилирование H4 в повторно реплицирующихся источниках, исследователям необходимо знать, какие из клеточных источников подвергаются повторной репликации в клетках E1A+ в поздней S-фазе. исследователи планируют идентифицировать ориджины, активированные в клетках E1A+, в том числе те, которые ререплицируются. Как только исследователи идентифицируют одно или два источника повторной репликации, исследователи будут количественно определять ацетилирование с использованием этих источников происхождения в клетках, экспрессирующих помеченные эпитопом WT и мутантные аллели HBO1 и E1A. исследователи ожидают качественного или количественного (или обоих) ацетилирования H4 из-за E1A.

6. Ожидаемые результаты и подводные камни:

В конце всех предложенных экспериментов исследователи ожидают определить, является ли стимуляция активности HBO1 HAT с помощью E1A критической для активации ориджина в клетках E1A+ и играет ли индуцированная E1A активность HAT роль в повторной репликации. Исследователи не предвидят каких-либо технических или иных проблем, в том числе с получением соответствующих реагентов.